Applying Culturomics Approach for the Isolation and Identification of Previously Uncultured Fungi

实验目的

近年来，新兴微生物培养组学技术（原位培养，富集培养，微流控技术）的进步极大地促进了原核微生物的分离培养（Berdy et al., 2017; Mu et al., 2018）。然而绝大多数真菌具有丝状生长的特性，很难直接应用在原核微生物分离中成功的一些方法，关于真菌等真核微生物相关的原位培养和富集培养等培养组学技术还鲜有报导（周士越等, 2020）。利用分离芯片装置（isolation chip，ichip）开展原位培养能模拟微生物生长的自然环境，分离培养获得很难在人工培养基上生长的微生物类群，并发现重要的次级代谢产物（Piddock, 2015; Berdy et al., 2017）。富集培养法（enrichment culture）则能利用不同微生物间生命活动、生长条件及群体感应等特点，复苏处于休眠状态的微生物（Garcia, 2016），进而分离出未培养、难培养的真菌类群。本实验以沿海滩涂沉积物为分离材料，介绍原位培养及富集培养的主要方法步骤。与常规方法相比，该方法有助于研究者分离培养获得多样性更高的真菌物种，发现以前未培养的真菌新类群。实际操作过程中，可根据实际情况对方法加以调整。

材料与试剂

1. 96孔分离装置（中国，深圳市万鑫达塑胶材料有限公司）
2. 聚丙烯PP（中国，深圳市万鑫达塑胶材料有限公司）
3. 无菌生物滤膜（0.22 μm尼龙，中国，北京科龙生物医学技术有限公司）
4. 鱼缸专用高性能有机硅胶（YG680-150A，中国，苏州市学然贸易有限公司）
5. 医用不锈钢304消毒网框（0.4 cm孔径, 中国，鼎正医疗器械有限公司）
6. 各种型号枪头
7. 八连排PCR管
8. 离心管
9. 玻璃涂布棒
10. 马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB，BD Difco，美国，货号：254920）
11. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，BD Difco，美国，货号：213400）
12. 氨苄青霉素（Macklin，中国，货号：A6265）
13. 链霉素（Macklin，中国，货号：S858247）
14. Rapid Taq Master MIX（Vazyme，中国，货号：P222-03）
15. 氯仿（国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯）
16. 异戊醇（国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯）
17. 无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯）
18. M5 Gelred Plus核酸染料（北京聚合美生物科技有限公司，中国，货号：MF079-plus-01）
19. 双蒸水
20. 琼脂糖（国药集团化学试剂有限公司，中国，货号：YC-SJ99022）
21. CTAB（北京索莱宝科技有限公司，中国，货号：C8440-100g）
22. 海盐（SIGMA，美国，货号：S9883-500G）
    

仪器设备

1. 超净工作台（北京亚泰科隆，中国，型号：S858247）
2. -80 ℃冰箱（ThermoFisher Scientific，美国，型号：YT-CJ-1D）
3. 恒温培养箱（福意联，中国，型号：FYL-YS-150L）
4. 恒温振荡器（一恒，中国，型号：7J9671）
5. Vortex-Genie 2涡旋仪（Scientific Industries，美国，型号：SI-0266）
6. 组织破碎仪（新芝生物科技，中国，型号：Scientz-48）
7. 离心机（Sigma，美国）
8. 恒温水浴锅
9. 电泳仪
   

实验步骤