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基于PacBio SMRT三代测序的红树林沉积物真菌群落的研究

Analysis of Fungal Community in Mangrove Sediments Based on PacBio SMRT Sequencing

张 张志峰
李 李猛

发表时间: 2021年04月23日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003701 浏览次数: 3293

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：虽然二代测序可以在短时间内产生大量高质量的数据，但由于读长原因，测序结果并不能准确的鉴定到种水平，因而在环境微生物群落的鉴定上仍存在一定的局限性。以circular consensus sequencing (CCS) 技术为基础的PacBio SMRT三代测序技术，可以产生长度可达十至数十kb的高质量DNA数据，能够完整的覆盖细菌16S rDNA，真菌18S/28S rDNA和ITS区域，甚至18S rDNA+ITS+28S rDNA区域全长，可以有效的解决注释精度的问题。在本研究中，通过红树林沉积物样品采集，DNA提取，PCR扩增，PacBio SMRT测序和数据分析，最终获得高注释精度的真菌群落OTU table。以此为基础，通过后续的生态学分析，对红树林真菌群落的多样性、组成、分布规律、影响因素、群落组装过程、物种相互作用关系等方面有深刻认识。分析方法部分同样适用于其他环境微生物群落PacBio SMRT三代扩增子测序数据的分析。

Keywords: PacBio SMRT search 真菌群落 search 扩增子测序 search

材料与试剂

  1. DNeasy PowerSoil Kit (Qiagen, catalog number: 12888-50/12888-100) 或 FastDNA Spin Kit for soil (MP Biomedicals, catalog number: 116560)
  2. PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara, catalog number: R050) 或 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific, catalog number: F537L)
  3. 无菌超纯水

仪器设备

  1. 沉积物采样器
  2. 涡旋振荡器 (带适配器) /组织研磨仪 (MP Biomedicals, MP Fastprep-24 5G)
  3. NanoDrop ND-2000c UV-Vis spectrophotometer (NanoDrop Technologies)
  4. ProFlex™ PCR仪 (ThermoFisher)

软件和数据库

一、软件

  1. pbccs (v4.02, https://github.com/PacificBiosciences/ccs)
  2. BAM2fastx (https://github.com/pacificbiosciences/bam2fastx/)
  3. lima (v1.11.0, https://github.com/pacificbiosciences/barcoding/)
  4. flexbar (v3.0, https://github.com/seqan/flexbar)
  5. mothur (v1.44.2, https://github.com/mothur/mothur/releases/tag/v1.44.2)
  6. vsearch (v2.15.0, https://github.com/torognes/vsearch/releases/)
  7. ITSx (v1.0.11, https://microbiology.se/software/itsx/)
  8. usearch (v10.0.240, https://drive5.com/usearch/)
  9. BLAST+ (v2.10.1, https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)
  10. RAxML (v8.2.12, https://github.com/stamatak/standard-RAxML)
  11. IQTree (v2.1.1, http://www.iqtree.org)
  12. FastTree (v2.1.11, http://www.microbesonline.org/fasttree/)

二、数据库

  1. UNITE (v8.2, https://doi.org/10.15156/BIO/786372) for ITS
  2. Silva (release 138, https://www.arb-silva.de/documentation/) for 16S/18S rDNA
  3. UCHIME reference dataset (v7.2, https://unite.ut.ee/repository.php)


实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：张志峰, 李猛. (2021). 基于PacBio SMRT三代测序的红树林沉积物真菌群落的研究. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003701. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003701.
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How to cite: Zhang, Z. F. and Li, M. (2021). Analysis of Fungal Community in Mangrove Sediments Based on PacBio SMRT Sequencing. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003701. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003701.
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分类

系统生物学 > 微生物组学

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