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原生质体法制备根系腐生型共生菌 (伞菌目) 单核化菌丝

Protoplast Regeneration to Obtain Monokaryotic Strain from the Quercus-Associated Clitopilus hobsonii

王 王玉宸
王 王欣玉
彭 彭龙
袁 袁志林

发表时间: 2021年04月27日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003653 浏览次数: 3525

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：菌体单核化的方法主要包括机械分割法、化学处理法、孢子分离法和原生质体再生法等。机械分割法对细胞破坏程度大，分割后细胞存活率降低，而且分割产物不均匀，单核体得率低；化学处理法对于处理条件要求严格，具有细胞毒性；孢子分离法仅适用于产孢菌株单核体的制备，且单核孢子的形成需要经过遗传重组、减数分裂，因而遗传信息不能完整保留；原生质体再生法制备的单核体未经过减数分裂及遗传重组，亲本细胞核内的遗传信息能更为完整、准确地保留，而且经过再生后能够获得两种核型的单核体。本文介绍了异核双核体担子真菌原生质体再生单核化技术，以及单核体菌株的鉴定方法，为开展真菌基因组测序和高质量组装提供技术依据。

Keywords: 担子菌 search 单核体 search 原生质体 search

研究背景

荷伯生氏斜盖伞Clitopilus hobsonii (Agaricales) 首次分离自栎类林腐木 (Orton, 1960)，是典型的土壤腐生真菌。笔者发现该菌在大果栎Quercus macrocrpa、舒玛栎Quercus shumardii、牛栎Quercus michauxii、琴叶栎Quercus lyrata、白栎Quercus fabri等新鲜菌根组织中均能分离到。进一步研究发现，该菌能够促进栎类幼苗生长，且与多种苗木建立共生关系，形成类似“微菌核”的侵染结构，促进苗木根系发育和养分吸收。笔者认为破译该菌的遗传信息可能为丰富外生菌根真菌起源于腐生真菌这一学说提供更多的基因组进化证据。然而该菌株为异核双核体，基因组存在不同程度的杂合率，这将给基因组组装和注释带来一定挑战，影响后续进化生物学分析和功能研究。单核化作为“简化”复杂基因组的一种策略，是有效开展异核双核真菌全基因组测序分析的重要环节。因此，制备荷伯生氏斜盖伞单核体菌株将为顺利开展基因组测序和组装奠定基础。

材料与试剂

  1. 纱布
  2. 无纺布
  3. 10 ml注射器
  4. 0.45 μm滤膜
  5. 50 ml离心管
  6. 荷伯生氏斜盖伞双核体菌株
  7. DAPI (sigma, catalog number: D9542) 
  8. 细胞壁裂解酶 (sigma, catalog number: L1412)
  9. 真菌基因组DNA快速提取试剂盒 (Aidlab, catalog number: DN4102)
  10. I-5™ 2× High-Fidelity Master Mix (TSINGKE, catalog number: TP001)
  11. 琼脂糖 (Genview, catalog number: 9012-36-6)
  12. 超纯水
  13. ddH2O
  14. 葡萄糖 (Macklin, catalog number: D810588)
  15. 酵母提取物 (Oxoid, catalog number: LP0021)
  16. 琼脂 (BD, catalog number: 214010)
  17. 麦芽提取物(Cool Chemistry, catalog number: BL360016)
  18. 蔗糖 (沪试, catalog number: 10021418)
  19. NaCl (沪试, catalog number: 10019318)
  20. KH2PO4 (沪试, catalog number: 10017618)
  21. K2HPO4 (沪试, catalog number: 20032118) 
  22. PDA培养基 (见溶液配方)
  23. YMG液体培养基 (见溶液配方)
  24. MYG再生培养基 (见溶液配方)
  25. 0.5 M蔗糖溶液 (见溶液配方)
  26. 0.1 M PBS缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 盖玻片
  2. 载玻片
  3. 打孔器
  4. 250 ml锥形瓶
  5. 涂布棒
  6. 漏斗
  7. 镊子
  8. 直尺
  9. 电泳仪 (六一, model: DYY-6C) 
  10. 全温振荡器 (培英, model: THZ-C-1)
  11. 生化培养箱 (博讯, model: SPX-250B-Z)
  12. 台式高速冷冻离心机 (Sigma, model: 3K15) 
  13. 电热鼓风干燥箱 (新诺, model: 101-0AS) 
  14. 立式压力蒸汽灭菌器 (申安, model: LDZF-50KB-II) 
  15. 激光共聚焦荧光显微镜 (Carl Zeiss, model: LSM700) 
  16. PCR扩增仪 (BIO RAD, model: MyCyclerTM Thermal Cycler)
  17. 光学显微镜 (Carl Zeiss, model: Axio Scope A1)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：王玉宸, 王欣玉, 彭龙, 袁志林. (2021). 原生质体法制备根系腐生型共生菌 (伞菌目) 单核化菌丝. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003653. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003653.
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How to cite: Wang, Y. C., Wang, X. Y., Peng, L. and Yang, Z. L. (2021). Protoplast Regeneration to Obtain Monokaryotic Strain from the Quercus-Associated Clitopilus hobsonii. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003653. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003653.
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分类

系统生物学 > 微生物组学

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