High-throughput Cultivation and Identification of Bacteria from the Plant Root Microbiota

研究背景

根系是植物吸收营养和水分的主要器官，也是植物和微生物互作的主要场所。自然生长的植物根系表面及内部从土壤中富集了大量且种类繁多的微生物，统称为根系微生物组。这些微生物包括有益、有害和中性微生物，在植物的生长过程中扮演着重要角色。植物根系微生物组的研究主要以描述性工作为主，利用高通量扩增子和宏基因组测序技术，描述自然土壤中生长的各种植物根系微生物组的物种分类和基因组成。该领域正在进入快速发展期，下一阶段必然着重研究根系微生物组在植物中的功能，并逐渐揭示植物与根系微生物组互作过程的分子机制。目前，阻碍根系微生物功能及植物与微生物互作研究的关键因素是根系微生物资源。尽管国际储备中心已经存储了成千上万的微生物，但这些微生物来自于多种环境和物种。微生物在特定生态位的定殖能力很可能在不同栖息地和不同物种根部产生分化，因此有必要从给定的土壤和宿主中分离培养原位的微生物，为根系微生物的功能及与植物的互作研究提供更好的菌种资源。

材料与试剂

一、耗材

1. 滤纸 (SEP, catalog number: DXLZ11F)
2. 50 ml离心管 (BD Falcon, catalog number: 352070)
3. 微量离心管 (1.5, 5 ml; Eppendorf, catalog number: 0030125.150, 30119401)
4. 塑料研磨棒 (Huaaobio, catalog number: SLXMB-1.5)
5. 13 cm方板 (Axygen, catalog number: ASJ-17-9142)
6. 60 mm培养皿 (Corning, catalog number: 430166)
7. 96孔PCR板 (Jet Keen Biotechnology, catalog number: PC-0200-9B)
8. 96孔细胞培养板 (NEST, catalog number: 701001)
9. 96孔酶标板 (Costar, catalog number: 3590)
10. 2.0 ml冻存管 (NEST, catalog number: 607001)
11. Microbank菌保管 (Prolab, catalog number: PL.170/M)
12. 移液器枪头 (nuclease-free, 10, 200, 1000 µl; Axygen, catalog numbers: T-300, T-200-Y, T-1000-B)
13. Parafilm封口膜 (Bemis, catalog number: PM-996)
14. 96孔PCR板封板膜 (Axygen, catalog number: PCR-TS)
    
    

二、生物材料

1. 样品来源于水稻根系 (Oryza sativa L. Nipponbare)，植物材料可从作者处获得
2. E. Coli (TIANGEN BIOTECH, DH5α, catalog number: CB101-03)
   
   

三、试剂

1. 胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB, OXOID, catalog number: CM0129)
2. 氯化镁 (MgCl₂·6H₂O, SIGMA, catalog number: 63068-250G)
3. 氯化钠 (NaCl, SIGMA, catalog number: S7653-250G)
4. 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄·2H₂O, SIGMA, catalog number: 04272-1KG)
5. 磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄·H₂O, SIGMA, catalog number: 71504-250G)
6. 氢氧化钠 (NaOH, SIGMA, catalog number: S8045-500G)
7. 乙二胺四乙酸二钠 (Na₂-EDTA·2H₂O, Amresco, catalog number: 0105)
8. 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl, Genview, catalog number: BT504-500G)
9. 甘油 (SIGMA, catalog number: G7893)
10. 琼脂粉 (SIGMA, catalog number: A7921-100G)
11. 琼脂糖 (Biowest, catalog number: G-10)
12. 乙醇 (SIGMA, catalog number: E7023-500ML)
13. 无核酸酶水 (QIAGEN, catalog number: 129115)
14. PCR引物 (Life Technologies)
15. PCR反应体系试剂 (TAKARA, catalog number: R007Z)
16. 2000 bp Plus DNA标准物 (DiNing, catalog number: DM1003)
17. DNA染色剂 (NIPPON Genetics EUROPE GmbH, catalog number: MG04)
18. 胶回收试剂盒 (Wizard^® SV Gel and PCR Clean-up System, Promega, catalog number: A9282)
19. 磁珠 (Agencourt AMPure XP beads, Beckman, catalog number: A63882)
20. PicoGreen荧光染料 (Invitrogen, catalog number: P7589)
21. 三羟甲基氨基甲烷 (Tris, Vetec, catalog number: V900483-500G)
22. 乙酸 (Rhawn, catalog number: R049946-500ML)
23. 上样缓冲液 (TAKARA, catalog number: 9156)
    

仪器设备

1. 镊子 (Jinzhong, catalog number: JD5020)
2. 剪刀 (Jinzhong, catalog number: J21130)
3. 切胶刀片 (Jinzhong, catalog number: J11010)
4. 12通道移液器 (10, 100, 300 µl; Eppendorf, catalog numbers: 3122000027, 3122000043, 3122000060)
5. 单道移液器 (10, 20, 100, 200, 1000 µl; Eppendorf, catalog numbers: 3120000020, 3120000038, 3120000046, 3120000054, 3120000062)
6. 生物安全柜 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: BSC-1000IIA2)
7. 旋涡混合器 (TIAGEN BIOTECH, catalog number: OSE-VS-01)
8. 电子天平 (Mettler Toledo, catalog number: AL104)
9. 平板摇床 (Kylin-Bell Lab Instruments, catalog number: TS-2)
10. 恒温摇床 (Shanghai Zhichu Instrument, catalog number: ZQZY-CF)
11. 微孔板离心机 (TIANGEN BIOTECH, catalog number: OSE-MP26)
12. PCR仪 (T100TM; BIO-RAD, model: 1861096)
13. 电泳仪 (JUNYI-DONGFANG, catalog number:JY300HC)
14. 凝胶成像仪 (BIO-RAD, model: Universal Hood II)
15. 酶标仪 (Molecular Devices®, model: PARADIGM)
16. 紫外分光光度计 (Thermo Fisher Scientific, model: NanoDrop ND-2000)
17. 高速离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
18. 磁力架 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 12321D)
19. 高速微型离心机 (Thermo Fisher Scientific, model: Heraeus Pico 17)
20. -80 °C超低温冰箱 (Thermo Fisher Scientific, model: 907)
21. -20 °C冰箱(Haier, catalog number: DW-40L92)
    

软件和数据库

个人电脑访问网络服务器 (http://bailab.genetics.ac.cn/culturome/) 即可在线开展数据分析。本地分析可使用VirtualBox运行流程的镜像 (https://github.com/YongxinLiu/Culturome)。如果需要将软件布置在自己的服务器上开展大规模或个性化分析，需要在64位Linux系统 (如Ubuntu 16.04+或CentOS 7.5+，> 4GB内存，> 30GB硬盘空间) 安装以下软件和数据库。

1. 软件管理器Conda 4.8.3+ (https://repo.anaconda.com/miniconda)
2. R语言 3.4+ (https://cran.r-project.org)。本流程分析基于R 3.5.1，并安装了 ggplot2 ( Wickham，2016)、pheatmap (Kolde, 2015) 、dplyr和stringr包。
3. QIIME v1.9.1 (Caporaso et al., 2010) http://qiime.org 用于混池测序根据序列 标签拆分样本
4. USEARCH v10.0.240 (Edgar and Flyvbjerg，2015) http://www.drive5.com/usearch
5. VSEARCH v2.7.1+ (Rognes et al., 2016) https://github.com/torognes/vsearch
6. GraPhlAn 1.1.3-1+ (Asnicar et al., 2015) 绘制物种分类树
7. Culturome v1.0分析流程、相关和示例结果 https://github.com/YongxinLiu/Culturome示例测序数据：本文件使用数据保存于中国科学院基因组研究所国家生物信 息中心 (China National Center for Bioinformation) (Partners, 2020) 组学原始数 据归档库 (Genome Sequence Archive，GSA) (Wang et al., 2017) 中，访问编号 CRA002517。
   RDP训练集16 (Cole et al., 2014) 作为分类数据库，USEARCH格式数据下载链接 http://www.drive5.com/sintax
   

实验步骤