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人类肠道病毒粒子富集及纳米孔测序

Enrichment and Nanopore Sequencing of Human Gut Virus-like Particles

曹 曹佳宝*
张 张雨青*
赵 赵娜
王 王军

*Contributed equally to this work 发表时间: 2021年02月25日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003610 浏览次数: 3875

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：病毒作为微生物组的重要组成部分，具有较高的多样性，但是在环境中的含量较低，直接测序得到的病毒序列极少，限制了病毒组的研究。为了对人类粪便样本中肠道病毒粒子进行富集，同时提取核酸并进行扩增和测序。本实验通过使用给定孔径范围的滤膜对病毒粒子进行初步过滤。然后，根据病毒粒子的大小、密度和形状等物理特性，使用超速离心机对其进行沉降富集。最终，获得纯净的病毒粒子。该方法可有效提高病毒粒子的含量，使病毒有效数据提升至70%左右（包含未知序列），为病毒组的下游分析奠定基础。此外，运用该方法获得的病毒cDNA扩增产物除用于Nanopore测序，还可用于Illumina测序。

Keywords: 人类肠道病毒组 search VLPs search 富集 search 扩增 search

材料与试剂

  1. 0.45 μm PVDF滤器 (Millex-HV)
  2. 各种型号枪头
  3. 1.5 ml、15 ml、50 ml离心管
  4. 超速离心管 (Beckman, catalog number: 355654)
  5. TURBO DNase I (Invitrogen, catalog number: AM2238)
  6. RNase A (QIAGEN)
  7. 10 mM dNTP mix (Promega, catalog number: U1515)
  8. M-MLV reverse transcriptase (Promega, catalog number: M1705)
  9. Klenow fragment (Taraka, catalog number: 2140A)
  10. QIAamp MinElute virus spin kit (QIAGEN, catalog number: 57704)
  11. DEPC水 (Ambion, catalog number: AM9922)
  12. KOD-Plus DNA polymerase (Toyobo, catalog number: KOD-201)
  13. 琼脂糖 (Invitrogen, catalog number: 75510-019)
  14. QIAquick gel extraction kit (QIAGEN, catalog number: 28704)
  15. Ligation sequencing kit (Oxford Nanopore, catalog number: SQK-LSK109)
  16. Native barcoding kit (Oxford Nanopore, catalog number: EXP-NBD104)
  17. NEBNext FFPE DNA repair mix (NEB, catalog number: M6630L)
  18. Ultra II End-prep enzyme mix (NEB, catalog number: E7372AA)
  19. Blunt/TA ligase master mix (NEB, catalog number: M0367L)
  20. Quick T4 DNA ligase (NEB, catalog number: E6057AA)
  21. 核酸染料 (Mei5bio, catalog number: MF079-plus-05)
  22. 6x DNA loading buffer (Tiangen, catalog number: RT201-01)
  23. Trans 15K DNA marker (全式金生物，catalog number: BM161-01)
  24. Primer Rrm (5′-GACCATCTAGCGACCTCCAC - NNNNNN-3′)
  25. Primer Rm (5′-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC-3′)
  26. DNA beads (Beckman, catalog number: A63987)
  27. Qubit dsDNA HS assay kit (Invitrogen, catalog number: Q32854)
  28. Ribonuclease inhibitor (Promega, catalog number: N2515)
  29. PBS缓冲液 (见溶液配方)
  30. TBE缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 冷冻离心机 (Beckman Coulter, model: AllegraTM X-22R)
  2. 高速冷冻离心机 (Thermo Heraeus FERSCO 17 Centrifuge)
  3. 超速冷冻离心机 (Beckman Coulter, model: XP-100)
  4. 掌上离心机
  5. 高压蒸汽灭菌锅
  6. PCR仪
  7. 凝胶成像系统
  8. 电泳仪
  9. 恒温水浴锅
  10. 超净工作台
  11. PromethION测序仪
  12. 制胶槽和梳子
  13. 手术刀
  14. 磁力架
  15. 电子天平
  16. QubitTM 4 Fluorometer

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：曹佳宝, 张雨青, 赵娜, 王军. (2021). 人类肠道病毒粒子富集及纳米孔测序. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003610. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003610.
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How to cite: Cao, J. B., Zhang, Y. Q., Zhao, N. and Wang, J. (2021). Enrichment and Nanopore Sequencing of Human Gut Virus-like Particles. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003610. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003610.
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分类

系统生物学 > 微生物组学

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