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Cas-16S-seq：利用CRISPR/Cas9靶向消除16S-seq中高丰度植物序列的方法

Cas-16S-seq: Using CRISPR/Cas9 to Eliminate Abundant Plant Sequences in 16S-seq

宋 宋露洋
谢 谢卡斌

发表时间: 2021年04月13日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003588 浏览次数: 3032

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：16S rRNA基因高通量测序 (16S-seq) 是研究微生物组的常用方法之一。在分析植物或其他高等生物的样品时，线粒体和质体16S rRNA基因也被通用引物扩增，造成测序结果中宿主序列的污染最高达99%以上，不仅提高了成本，而且极大地限制了16S-seq方法分析植物微生物群落结构的灵敏度。Cas-16S-seq的方法是一种利用CRISPR/Cas9靶向切割植物16S rRNA基因序列从而富集扩增产物中细菌序列的方法 (图1) (Song和Xie，2020)。该方法操作简单，可以方便地整合到已有的16S-seq流程中，能高效率地消除共扩增的高丰度植物序列。我们的分析也表明Cas9具有高特异性，通过使用我们开发的生物信息学平台设计的植物特异的gRNA，未检测到脱靶切割细菌16S rRNA的现象。本文以水稻为例，描述了Cas-16S-seq的详细步骤和实验要点，为科研人员使用该方法分析植物微生物组提供参考。

Keywords: 16S rRNA基因高通量测序 (16S-seq) search CRISPR-Cas search 宿主污染 search 微生物组 search 植物 search

材料和试剂

  1. 50 ml离心管 (Corning, catalog number: 430829)
  2. RNase-free 0.2 ml PCR管 (Axygen, catalog number: PCR-02D-C)
  3. RNase-free 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
  4. 丁腈手套 (AMMEX, catalog number: APFNCHD50)
  5. Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIP) (New England Biolabs, catalog number: M0290S)
  6. Bsa I (New England Biolabs, catalog number: R0535S)
  7. Cas9 (New England Biolabs, catalog number: M0386S)
  8. DH5α (Vazym, catalog number: C502-03)
  9. Protease K (New England Biolabs, catalog number: P8107S)
  10. T4 DNA ligase (New England Biolabs, catalog number: M0202S)
  11. T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) (New England Biolabs, catalog number: M0201S)
  12. pUC19-gRNA (Addgene plasmid #137776，质粒图谱见图1)


    图1. pUC19-gRNA载体示意图

  13. 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (TaKaRa, catalog number: RR176)
  14. Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog number: A63880)
  15. DNeasy Powersoil Kit (QIAGEN, catalog number: 12888-50)
  16. Gel Extraction Kit (OMEGA, catalog number: D2500-02)
  17. HiScribe Quick T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs, catalog number: E2050)
  18. I-5 2× High-Fidelity Master Mix (Molecular Cloning Laboratories, catalog number: I5HM-200)
  19. QIAGEN plasmid mini kit (QIAGEN, catalog number: 12123)
  20. RNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research, catalog number: R1017)
  21. Double-distilled H2O (ddH2O)
  22. KCl (Fisher Scientific, catalog number: P217-500)
  23. KH2PO4 (Fisher Scientific, catalog number: P285-500)
  24. LE Agarose (Hydragene, catalog number: R9012LE-100g)
  25. NaCl (Fisher Scientific, catalog number: S271-1)
  26. Na2HPO4 (Fisher Scientific, catalog number: S374-500)
  27. TWEEN 20 (Fisher Scientific, catalog number: BP337-100)
  28. 75%乙醇，80%乙醇 (用95%乙醇和0.1‰ DEPC处理水配制)
  29. 75%医用酒精 (国药试剂)
  30. 氨苄青霉素 (国药试剂)
  31. 苯酚 (国药试剂)
  32. 焦碳酸二乙酯 (DEPC, Sigma, catalog number: D5758)
  33. 氯仿 (国药试剂)
  34. 无核酸酶水 (Zymo Research, catalog number: W1001-4)
  35. 无水乙醇或95%乙醇 (国药试剂，分析纯)
  36. 无水乙酸钠 (国药试剂，分析纯)
  37. 液氮
  38. 磷酸盐缓冲溶液 (见溶液配方)
  39. 0.1‰ DEPC处理水 (见溶液配方)
  40. 3 M 醋酸钠 (pH 5.2) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 96孔磁铁架 (BORHEE, catalog number: MAG-96-11)
  2. 剪刀和镊子
  3. 研磨钵和研磨棒
  4. 移液器 (2.5，20，200，1,000 μl) (Labnet, catalog numbers: 540910296, 340930114, 240750135, 440960631)
  5. NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, catalog number: ND-ONE-W)
  6. DNA电泳装置
  7. 超净工作台
  8. 小型离心机 (Eppendorf, catalog number: 022620498)
  9. 台式离心机 (Cence, catalog number: TDZ5-WS)
  10. 涡旋振荡器 (Scientific Industries, catalog number: G560E)
  11. 水浴锅
  12. 37 °C恒温培养箱
  13. PCR热循环仪 (Bio-Rad Laboratories, S1000TM Thermal Cycler, catalog number: 1852148)
  14. 研钵和研磨棒
  15. -20 °C冰箱
  16. pH计 (METTLER TOLEDO, catalog number: FE20K)

软件和数据库

  1. VSEARCH软件 (version 2.8.1)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：宋露洋, 谢卡斌. (2021). Cas-16S-seq：利用CRISPR/Cas9靶向消除16S-seq中高丰度植物序列的方法. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003588. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003588.
ris ris 下载引用格式
How to cite: Song, L. Y. and Xie, K. B. (2021). Cas-16S-seq: Using CRISPR/Cas9 to Eliminate Abundant Plant Sequences in 16S-seq. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003588. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003588.
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分类

系统生物学 > 微生物组学

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