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微生物群落胞内/胞外吸附/胞外游离水环境DNA的分离提取

Isolation and Extraction of Intracellular, Absorbed-extracellular and Free-extracellular Environmental DNA from Aquatic Microbial Community

赵 赵泽
鞠 鞠峰

发表时间: 2020年12月25日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003587 浏览次数: 7637

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：胞外DNA是位于微生物细胞膜外的DNA片段，来自于微生物的主动/被动排放或细胞裂解，作为微菌落的结构成分发挥着重要的作用。本实验流程通过过滤、洗脱再过滤的二级处理将环境水体中微生物组的胞内/胞外吸附/胞外游离DNA分离，并且在十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 提取DNA的方法上进行优化，实现大体积水样中微量胞外游离/胞外吸附DNA的分离提取，并且适用于不同类型环境样品。该方案得到的胞内/胞外吸附/胞外游离DNA可用于下游的PCR、qPCR、标记基因扩增子测序、宏基因组测序等相关分析。胞内DNA适用于探究微生物群落结构与功能；胞外吸附/胞外游离环境DNA (eDNA) 适用于水环境生物多样性评估、生物入侵预警与防治以及濒危物种保护。

Keywords: 胞外游离DNA search 胞外吸附DNA search 胞内DNA search CTAB search

材料与试剂

材料：

  1. 15 ml离心管 (CORNING, CentriStar, catalog number: 430790)
  2. 50 ml离心管 (CORNING, CentriStar, catalog number: 430828)
  3. 1.5 ml离心管 (AXYGEN, catalog number: MCT-200-C)
  4. 2 ml离心管 (AXYGEN, catalog number: MCT-150-C)
  5. 0.2 μm聚碳酸酯微孔滤膜 (Millipore, Isopore, PC Membrane, 47 mm, catalog number: GTTP04700)
  6.  移液吸头 (QSP, 10 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl, 1,000 μl, 5 ml)
  7. 冰盒
试剂：
  1. CTAB (Solarbio, catalog number: C8440)
  2. Tris (Solarbio, Ultra Pure Grade, catalog number: T8060)
  3. Tris-HCl (Sigma, BioUltra, for molecular biology, catalog number: 93363)
  4. EDTA (Solaibio, Biotechnolongy Grade, catalog number: E8030)
  5. 苯酚-氯仿-异戊醇 (Solarbio, catalog number: P1012-100)
  6. 氯仿-异戊醇 (Solarbio, catalog number: P1014-100)
  7. 异丙醇 (Acros, catalog number: 447080010)
  8. 氯化钠 (Sigma, for molecular biology, catalog number: S3014)
  9. 氢氧化钠 (Sigma, catalog number: 71687)
  10. 琼脂糖 (Solarbio, catalog number: A8201)
  11. PBS缓冲液 (Thermo Fisher, catalog number: C10010500BT)
  12. 无水乙醇 (Sigma, BioUltra, for molecular biology, catalog number: 51976)
  13. FastDNA Spin Kit for Soil (Qiagen)
  14. UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (Thermo, catalog number: 10977023)
  15. Qubit检测试剂 (Thermo)
  16. CTAB提取液 (pH 8.0) (见溶液配方)
  17. 高盐TE buffer (pH 8.0) (见溶液配方)
  18. TE buffer (pH 8.0) (见溶液配方)
  19. Tris-HCl-EDTA提取液 (pH 8.0) (见溶液配方)
  20. 苯酚-氯仿-异戊醇 (可自配，见溶液配方)
  21. 氯仿-异戊醇 (可自配，见溶液配方)

仪器设备

  1. 剪刀
  2. 镊子
  3. 真空过滤器 (台湾洛科六联过滤器，MultiVac610-MS)
  4. 真空泵 (GAST, DOA-P504-BN)
  5. 移液枪 (Eppendorf, 0.5-10 μl, 2-20 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl, 0.5-5 ml)
  6. 台式大容量冷冻离心机 (Eppendorf, Centrifuge 5810R)
  7. 台式冷冻离心机 (Eppendorf, Centrifuge 5427R)
  8. 涡旋仪 (IKA, VORTEX2)
  9. 低温冷藏箱 (海尔，HYCD-290)
  10. 水浴锅
  11. NanoDropTM One/OneC (Thermo)
  12. Qubit 4 (Thermo)
  13. 核酸电泳仪 (上海天能，HE120+HE90+EPS300+VE-180)
  14. 全自动凝胶成像系统 (上海天能，TON-250)

实验步骤

Copyright: © 2020 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：赵泽, 鞠峰. (2020). 微生物群落胞内/胞外吸附/胞外游离水环境DNA的分离提取. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003587. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003587.
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How to cite: Zhao, Z. and Ju, F. (2020). Isolation and Extraction of Intracellular, Absorbed-extracellular and Free-extracellular Environmental DNA from Aquatic Microbial Community. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003587. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003587.
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分类

分子生物学 > DNA > DNA 检测

微生物学 > 微生物遗传学 > DNA

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