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菌酶一体化重组酵母工程菌的设计与构建

Design and Construction of Recombinant Yeast with Surface-displayed Enzymes

王 王谦
王 王佳堃
高 高德英

发表时间: 2021年02月25日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003558 浏览次数: 3146

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：酵母细胞表面展示是一种固定化表达异源蛋白的真核展示系统，在文库筛选、生物吸附、免疫检测和生物传感器研发等领域发挥重要作用。外源蛋白通过酿酒酵母a凝集素展示在细胞表面。a凝集素包含核心亚基AGA1及结合亚基AGA2。AGA1与酵母细胞壁β-葡聚糖共价连接，并通过两个二硫键与AGA2的N端共价相连。外源蛋白与AGA2的C端融合，从而实现外源蛋白在酿酒酵母细胞的表面展示。本实验通过AGA1和AGA2将外源蛋白固定在酵母细胞表面，获得菌酶一体化的微生物细胞反应器。

Keywords: a凝集素 search 外源蛋白 search 表面展示 search 酿酒酵母 search

材料与试剂

  1. 盖玻片 (上海生工公司, catalog number: F518117)
  2. 载玻片 (上海生工公司, catalog number: F518110)
  3. FALCON流式上样管 (BD, catalog number: 352003)
  4. 离心管
  5. 各种型号枪头
  6. 酵母提取物 (BBI Life Sciences, catalog number: A610961)
  7. 胰蛋白胨 (BBI Life Sciences, catalog number: A650217)
  8. NaCl (BBI Life Sciences, catalog number: A610476)
  9. 琼脂粉Agar (上海生工公司, catalog number: A505255)
  10. 琼脂糖Agarose M (上海生工公司, catalog number: A610013)
  11. pfu DNA聚合酶 (上海生工公司, catalog number: B500014)
  12. PCR产物纯化试剂盒 (上海生工公司, catalog number: B518141)
  13. DNA Marker: GeneRulerTM 100 by Plus DNA Ladder (Thermo ScientificTM, catalog number: SM0323)
  14. 限制性核酸内切酶 (Thermo ScientificTM, 中国)
  15. TreliefTM SoSoo Cloning Kit (SoSoo, catalog number: TSV-S2)
  16. Taq DNA聚合酶 (上海生工公司, catalog number: B500010)
  17. 质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I (OMEGA, catalog number: D6943-02)
  18. 酿酒酵母EBY100 (杭州余杭紫耕生物科技服务部)
  19. pYD1质粒 (Invitrogen, catalog number: V835-01)
  20. ProteinFind® Anti-V5 Mouse Monoclonal Antibody (TransGen Biotech, catalog number: HT401-01)
  21. FITC-conjugated Rabbit anti-mouse IgG (BBI Life Sciences, catalog number: D110101)
  22. 氨苄青霉素ampicillin，Amp (BBI Life Sciences, catalog number: A610028)
  23. D-(+)-葡萄糖 (BBI Life Sciences, catalog number: A610219)
  24. D-(+)-半乳糖galactose，Gal (BBI Life Sciences, catalog number: A600215)
  25. 酪蛋白水解物casaminoacid (BBI Life Sciences, catalog number: A603060)
  26. 无氮基础培养基yeast nitrogen base, without amino acids (上海生工公司, catalog number: A610507)
  27. L-亮氨酸leucine，Leu (BBI Life Sciences, catalog number: A100811)
  28. 醋酸锂粉末 (国药, catalog number: 30109760)
  29. Tris (上海生工公司, catalog number: A610195)
  30. PEG2000 (BBI Life Sciences, catalog number: A601785)
  31. EDTA (BBI Life Sciences, catalog number: A610185)
  32. LB (Luria-Bertani) 液体培养基 (见溶液配方)
  33. 0.5 mol/L EDTA (见溶液配方)
  34. 50x TAE (tris base-acetic acid-EDTA) 母液 (见溶液配方)
  35. 1x PBS (phosphate-buffer-saline) 缓冲液 (pH 7.4) (见溶液配方)
  36. 1 mol/L LiAc (见溶液配方)
  37. 10 mg/ml Leu (见溶液配方)
  38. 10x TE (Tris-EDTA) Buffer (见溶液配方)
  39. 50% PEG2000 (见溶液配方)
  40. TE/LiAc Buffer (见溶液配方)
  41. 40% PEG2000 (见溶液配方)
  42. 10x D (dextrose) (见溶液配方)
  43. YNB (yeast nitrogen base, without amino acids) 缺陷培养基 (见溶液配方)
  44. YNB-CAA (yeast nitrogen base-casamino acid) 培养基(见溶液配方)
  45. YPD (yeast extract-peptone-dextrose) (见溶液配方)
  46. 10x Gal (galactose) (见溶液配方)

仪器设备

  1. PCR仪 (Eppendorf, model: Mastercycler Pros)
  2. 核酸电泳仪 (北京市六一仪器厂, model: DYY-12)
  3. 凝胶成像仪 (Bio-Rad, Hercules, model: USAGel DocTM EZ)
  4. 空气恒温摇床 (宁波科技园区新江南仪器有限公司, model: KYC-100B)
  5. 生化培养箱 (宁波东南仪器有限公司, model: LRH-50)
  6. 紫外分光光度计 (上海美普达仪器有限公司, model: UV-3200)
  7. 离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge MiniSpin)
  8. 荧光显微镜 (Lecia, model: DFC450 C)
  9. 流式细胞仪 (BD, model: FACSVerse)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：王谦, 王佳堃, 高德英. (2021). 菌酶一体化重组酵母工程菌的设计与构建. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003558. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003558.
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How to cite: Wang, Q., Wang, J. K. and Gao, D. Y. (2021). Design and Construction of Recombinant Yeast with Surface-displayed Enzymes. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003558. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003558.
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分类

系统生物学 > 微生物组学

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