仪器设备

1.  (可选) 推荐使用计算服务器 (操作系统：Linux主流发行版本，如CentOS 7+/Ubuntu 16.04+；CPU：4核+；内存：16G+；硬盘：> 10 GB，且大于原始数据大小3倍) ，网络访问畅通。
2.  个人电脑推荐Windows 10系统，内存8G+。先在应用商店中安装Linux子系统 (如Ubuntu 20.04 LTS) ，然后安装QIIME 2；也可使用VirtualBox虚拟机运行QIIME 2镜像，但效率较低不推荐使用；Mac系统可直接安装QIIME 2。(可选) Windows用户远程访问服务器需安装XShell或Putty等终端类软件，Mac使用系统内置终端即可远程访问计算服务器。
   

软件和数据库

1.  QIIME 2可运行的四种环境任选其一：Linux服务器 (推荐，适合大数据) 、Windows 10子系统Ubutnu 20.04 LTS (推荐，适合小数据) 、Windows中VirtualBox虚拟机中运行Ubutnu 20.04 LTS (不推荐，小数据集且效率低) 、Mac系统 (不推荐，兼容性问题较多)
2.  软件管理器Miniconda3 Linux 64-bit (Python 3.8) ：https://conda.io/miniconda.html
3.  QIIME 2 (Bolyen et al., 2019) https://docs.qiime2.org/
4.  GreenGenes 13.8 (McDonald et al., 2011) 物种分类数据库：ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_8_otus.tar.gz
5.  流程示例参考代码和结果文件详见：https://github.com/YongxinLiu/MicrobiomeProtocol/blob/master/e2.QIIME2/，如示例代码为QIIME2_Pipeline.sh
6.  (可选) 远程文件传输工具FileZilla客户端3.49.1+：https://filezilla-project.org/
7.  (可选) Windows远程访问服务器终端工具Xshell 6.0.0197p+：https://www.netsarang.com/zh/free-for-home-school/
8. (可选) R语言环境，下载适合自己系统的安装包 （版本：4.0.2+）：https://www.r-project.org/
9.  (可选) R语言开发环境RStudio，用于执行流程，下载适合自己系统的安装包（版本：1.3.1056+）：https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/#download
   

软件安装和数据库部署

QIIME 2不支持在Windows系统下直接安装。我们主要介绍远程访问Linux服务器和Windows 10下安装Linux子系统并使用QIIME 2的两种方法，任选其一即可。
        方法1. 远程访问Linux服务器：Windows/Mac用户安装FileZilla客户端，用于上传测序数据至服务器或数据中心，也可用于下载分析结果本地查看。Windows用户安装Xshell用于远程访问服务器并开展分析，Mac用户可使用系统自带Terminal中的ssh命令远程访问服务器。
        方法2. Windows 10的1609以后的版本可以安装Linux子系统：开始→Microsoft Store→搜索“Ubuntu”→选择“Ubuntu 20.04 LTS”→安装。安装前的系统设置和常见问题请阅读《Windows10安装Linux子系统Ubuntu 20.04LTS》。安装成功后可以在开始中启动“Ubuntu 20.04 LTS”的命令行，也可选在RStudio中设置默认Terminal为“Bash (Windows Subsystem for Linux) ”，打开新终端即可使用。

1.  安装Miniconda3 Linux 64-bit (已安装请跳过)
   wget -c https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
   bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
   ~/miniconda3/bin/conda init
2.  下载QIIME 2流程安装软件列表
   直接wget下载，但有时无法下载，详见常见问题1。
   wget -c https://data.qiime2.org/distro/core/qiime2-2021.2-py36-linux-conda.yml
3.  Conda新建环境安装QIIME 2
   conda env create -n qiime2-2021.2 --file qiime2-2021.2-py36-linux-conda.yml
   进入工作环境
   conda activate qiime2-2021.2
4.  GreenGenes数据库下载并导入
   下载数据库文件 (greengenes) ，无法下载或下载慢见常见问题2
   wget -c ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_8_otus.tar.gz
   解压
   tar -zxvf gg_13_8_otus.tar.gz
   使用rep_set文件中的99_otus.fasta数据和taxonomy中的99_OTU_taxonomy.txt数据作为参考物种注释。
   导入参考序列
   qiime tools import \
       --type 'FeatureData[Sequence]' \
       --input-path gg_13_8_otus/rep_set/99_otus.fasta \
       --output-path 99_otus.qza
   导入物种分类信息
   qiime tools import \
       --type 'FeatureData[Taxonomy]' \
       --input-format HeaderlessTSVTaxonomyFormat \
       --input-path gg_13_8_otus/taxonomy/99_otu_taxonomy.txt \
       --output-path ref-taxonomy.qza
5.  训练分类器—全长 (通用) ，耗时约半小时
   time qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
       --i-reference-reads 99_otus.qza \
       --i-reference-taxonomy ref-taxonomy.qza \
       --o-classifier classifier_gg_13_8_99.qza
   如果提示版本错误，详见常见问题3。
6.  (可选) 训练分类器—指定V区分类器
   如果扩增了指定的16S区域，还可以构建特异区域的分类器，可进一步提高分类精度。常用GreenGenes 13_8按99%聚类操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTUs) 序列中的V4区域 (341F CCTACGGGNGGCWGCAG/805R GACTACHVGGGTATCTAATCC) 构建分类器。确定此处使用的引物与扩增引物保持一致。
           本次使用与测试数据对应的V5 (799F) - V7 (1193R) 引物为例进行提取序列，耗时约9分钟。
   time qiime feature-classifier extract-reads \
       --i-sequences 99_otus.qza \
       --p-f-primer AACMGGATTAGATACCCKG \
       --p-r-primer ACGTCATCCCCACCTTCC \
       --o-reads ref-seqs.qza
   基于筛选的指定区段，生成实验特异的分类器，耗时约8分钟。
   time qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
       --i-reference-reads ref-seqs.qza \
       --i-reference-taxonomy ref-taxonomy.qza \
       --o-classifier classifier_gg_13_8_99_V5-V7.qza
   

实验步骤