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锁核苷酸PCR解析植物内生细菌多样性方法

Locked Nucleic Acid (LNA) Oligonucleotide PCR Clamping Method for Investigating the Plant Endophyte Bacteria

于 于镇华
MI Makoto Ikenaga
MS Masao Sakai
王 王光华

发表时间: 2021年04月13日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003525 浏览次数: 3328

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：对植物内生细菌进行PCR扩增是内生细菌多样性研究的关键实验环节，对后续进一步解析植物内生细菌多样性和他们的生态功能具有重要意义。但是，由于植物线粒体和叶绿体SSU rRNA基因序列与细菌SSU rRNA基因序列存在高度的相似性，因此，采用传统的PCR扩增方法会带来大量源自植物细胞器扩增产物的污染，给后续的内生细菌群落结构分析带来干扰。为了克服这一难题，本方法采用锁核苷酸LNA (Locked Nucleic Acid) 引物对植物细胞器SSU rRNA进行锚定，可以有效地遏制植物细胞器SSU rRNA基因的扩增，从而达到特异性扩增内生细菌的SSU rRNA基因的目的。该方法可与高通量测序方法结合起来获取更多植物内生细菌多样性信息。

Keywords: 植物内生菌 search 锁核苷酸 search LNA search PCR search SSU rRNA基因 search

材料与试剂

  1. 枪头
  2. 无菌水
  3. 植物基因组DNA提取试剂盒 (BioTeke, catalog number: DP3111)
  4. High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianapolis IN, USA, catalog number: 11732668001)
  5. PCR相关试剂 (Takara RR030A Premix Ex Taq™ Hot Start Version, catalog number: RR030A)
  6. LNA扩增引物和细菌特异性扩增引物 (华大公司合成)

仪器设备

  1. 移液器
  2. 超纯水仪
  3. LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器
  4. -20 °C冰箱
  5. BIO-RAD低温离心机
  6. DYY-6C型电泳仪
  7. 超净工作台
  8. PCR仪
  9. Gel Doc凝胶成像系统
  10. FM40制冰机

实验原理

本方法的设计原理如图1所示，主要是通过设计与常规细菌PCR引物有交叠序列的、针对植物细胞器的特异性LNA引物，由于LNA引物的Tm值较高，因此可在较高温度(70 °C) 时与植物细胞器基因退火，而常规细菌PCR引物不能完成此过程。之后，由于交叠部分的碱基位置被LNA引物锚定，在较低温度的Tm值时，如54 °C时，常规PCR产物不能和植物细胞器基因退火，加之LNA引物的3'端引物被磷酸化，不能被用于PCR引物，PCR反应被终止，从而达到选择性的扩增细菌SSU rRNA基因，而抑制了植物细胞器基因扩增的目的。


图1. LNA-PCR工作原理简图

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：于镇华, Makoto Ikenaga, Masao Sakai, 王光华. (2021). 锁核苷酸PCR解析植物内生细菌多样性方法. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003525. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003525.
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How to cite: Yu, Z. H., Ikenaga, M., Sakai, M. and Wang, G. H. (2021). Locked Nucleic Acid (LNA) Oligonucleotide PCR Clamping Method for Investigating the Plant Endophyte Bacteria. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003525. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003525.
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分类

系统生物学 > 微生物组学

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