材料与试剂

1. 离心管 (2ml, Axygen, USA, catalog number: MCT-200-C)
2. 0.22 μm聚碳酸纤维膜 (GTBP) (Millipore, Billerica, MA, USA, catalog number: GTBP02500)
3. 滤膜衬垫纸 (Whatman, Grade GF/C：1.2µm, catalog number: 1822-055)
4. 0.22 μm针式过滤器 (Millipore, Millex-GP, catalog number: SLGPR33RB)
5. 多聚甲醛 (上海泰坦科技有限公司，catalog number: 410730010)
6. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: S9625-500G)
7. 10x磷酸缓冲盐溶液 (10x PBS溶液，pH =7.4，Sigma, catalog number: P5368)
8. 乙酸钠 (Sigma, catalog number: S5636)
9. 乙酸 (Sigma, catalog number: A6283)
10. Nycodenz (Axis-Shield, catalog number: 1002424)
11. SYBR Green I 核酸染料10,000× 浓缩液 (InvitrogenTM, catalog number: S7563)
12. 甘油 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: G7757-500ML)
13. 甲醇 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 179957-1L)
14. 0.5 M乙二胺四乙酸二钠溶液 (北京索莱宝科技有限公司，catalog number: E1170)
15. 十水焦磷酸钠 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 205975000)
16. 吐温80 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 278632500)
17. 肖特瓶 (100ml，Schott，catalog number：21801245)
18. 聚醚砜布氏漏斗 (25 mm，50 ml，PALL，catalog number: 4204)
19. 橡胶塞 (直径适配抽滤瓶，成阳公司，catalog number: 10025574028902)
20. 抽滤瓶 (GG-17，蜀牛玻璃抽滤瓶500 ml，catalog number: 45264074266)
21. 耐高温磁性搅拌子
22. 沉积物细胞固定液 (见溶液配方)
23. 醋酸缓冲液 (pH = 4.6) (见溶液配方)
24. 含3% NaCl的磷酸缓冲盐溶液 (见溶液配方)
25. 1x磷酸盐缓冲液 (见溶液配方)
26. 去污剂混合液 (见溶液配方)
27. Nycodenz密度梯度溶液 (见溶液配方)
28. 100x SYBR Green I染液 (见溶液配方)
29. 50%甘油 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 离心机 (Eppendorf 5430，德国，Eppendorf)
2. 涡旋仪 (Vortex Genie^® 2 Vortex，美国，MO BIO)
3. 移液枪 (10 μl, 200 μl, 1 ml，德国，Eppendorf)
4. 高压灭菌锅 (G154DWS，中国，致微仪器有限公司)
5. Nikon ECLIPSE 90i全自动科研级显微镜 (ECLIPSE 90i，日本，Nikon)
6. 荧光滤光块（FITC, Texas Red, 具体参数详见备注，日本，Nikon）
7. 真空泵 (津腾GM-0.5B，中国，津腾公司)
8. 超声波破碎仪 (Thermofisher, FB50220，美国，Thermofisher)
9. 电磁加热搅拌器 (TH-500，中国，上海沪西分析仪器厂)
   

荧光滤光块备注：

实验基本原理

海洋沉积物中含有大量的矿物和有机质颗粒，而微生物会附着在这些颗粒物的表面或者被这些颗粒物包裹。这会阻碍我们对沉积物中微生物多样性和生态功能的研究。本方法主要利用化学试剂溶解颗粒物，并结合超声破碎和密度梯度离心使细胞和颗粒物分离，最后收集细胞。基本原理如下：

1. 甲醛溶液固定细胞：甲醛可以迅速与细胞中氨基酸结合，并逐渐使蛋白质交联，致使细胞失活且内容物被包裹在交联的蛋白质网络内，起到固定细胞的作用。
2. 化学试剂剥离细胞：沉积物颗粒物中含有大量的碳酸盐和矿物质，化学法是利用乙酸溶解碳酸盐使附着在碳酸盐颗粒上的细胞脱离、加入甲醇和去污剂溶液 (吐温和焦磷酸) 有助于有机质 (蛋白质) 颗粒的解聚和溶解、EDTA可以螯和金属离子，改变矿物对细胞的吸附。
3. 超声剥离细胞：利用物质性质的差异，细胞与颗粒物在超声处理下震动频率不同，细胞与颗粒物的结合得以松散开来。
4. 密度梯度离心：可以利用不同浓度的Nycodenz溶液配制成密度梯度，通过离心，使得不同密度的细胞分布在不同的密度梯度中，大颗粒沉降到管底。同时，由于颗粒物在沉降过程中会在其后端引发湍流并拖拽附近细胞沉降，而越低的雷诺数越不易引发湍流。溶液粘度越高，雷诺数越低。因此，通过逐步提高溶液密度与粘度，离心管内湍流的形成会被显著抑制，最终将大部分细胞保留于密度梯度溶液中。
5. 荧光染色：荧光染色是通过SYBR Green I染液，是一种能够结合双链DNA双螺旋小沟区域的发射峰位于绿光区域的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但是与双链DNA结合后，荧光强度大大增强。可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
   
   
   图 1. 海洋沉积物中微生物细胞荧光染色图片
   
   

实验步骤