实验背景

实验通过氨基偶联在芯片表面固定SEB作为配体，流经Nb浓度梯度作为分析物，通过表面等离子体共振（SPR）技术检测Nb/SEB的相互作用，可获得结合与解离过程中的动力学信息，为后续Nb/SEB结合机制的研究提供线索与佐证。
在表面等离子体共振（SPR）实验中，配体密度是一个至关重要的参数，直接影响实验的灵敏度和结果的可重复性。配体密度过高可能导致空间位阻效应，阻碍分析物与配体的有效结合，甚至引发非特异性吸附，干扰数据解读；而密度过低则会降低信号强度，影响检测限和动态范围。因此，优化配体密度是确保SPR实验成功的关键步骤。通过精确控制配体在传感器芯片表面的固定量，可以实现分析物与配体之间相互作用的准确测量，从而获得可靠的动力学和亲和力数据。
在本次工作中，分别在Biacore 8K（cytiva）和S-CLASS（极瞳生命）两台SPR设备上测试同一配体高、中、低密度下的亲和力信息，对比研究不同配体密度下的互作行为。

材料与试剂

1.  SEB及纳米抗体，由Genewiz公司在Escherichia coli strain BL21 (DE3)内表达，蛋白表达纯化方法参见文献1。SEB分子量29 KD，纳米抗体分子量14 KD，新鲜纯化浓缩，浓度为5 mg/mL，储存在PBS缓冲液中。
2. Polariton CD5芯片（极瞳生命，产品目录号：CR1013）
3. 氨基偶联试剂盒（cytiva，产品目录号：BR100050）
4. 缓冲液：10× HBS-P+（cytiva，产品目录号：BR100671）
5. Polariton C5芯片（极瞳生命，产品目录号：PR1011）
6. 10 mM pH4.5醋酸钠缓冲液（极瞳生命，产品目录号：PR2033）
7. 氨基偶联试剂盒（极瞳生命，产品目录号：PR3002）
8. 缓冲液：10× HBS-T（极瞳生命，产品目录号：PR2012）
9. 再生试剂：10 mM pH 2.5 Glycine-HCl（极瞳生命，产品目录号：PR2042）
10. 其他耗材：1.5 mL EP管，1 mL、200 μL、10 μL枪头均为Axygen公司产品。
    

仪器设备

1. SPR分子互作系统（cytiva，仪器型号：Biacore 8K）
2. Biacore Insight评估软件4.08（cytiva）
3. BIAevaluation 软件（cytiva）
4. SPR分子互作系统（极瞳生命，仪器型号：S-CLASS）
5. Polariton SPR Workstation（极瞳生命，SW1001）

实验步骤