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稻瘟病菌分生孢子非靶定量脂质组的样品制备与检测方法

Sample Preparation and Detection Methods for Nontargeted Quantitative Lipidomics with Magnaporthe oryzae Conidia

刘 刘俏*
龙 龙茹慧*
梁 梁志彬
邓 邓懿祯

*Contributed equally to this work 发表时间: 2025年02月13日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1011019 浏览次数: 921

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摘要: 脂质广泛存在于动植物和微生物，是脂肪和类脂的总称。根据脂质的功能，可将其分为结构脂质和储存脂质两大类，两者均是生命活动所必需的。脂类物质的类型及空间分布影响着细胞质膜和细胞器膜的结构。脂肪酸酰基链对生物膜的性质，如脂质堆积、膜粘度和通透性等方面，起着重要作用。由高度不饱和脂肪酸组成的磷脂可以呈现各种形状，这有利于膜结构域的稳定和重塑，从而加快细胞的内吞速率。因此，细胞内脂质水平的定量检测对评估生物体正常的生长发育具有重要意义。本文通过超高效液相色谱-高分辨率串联质谱联用技术，对萌发过程中不同时间点的稻瘟病菌分生孢子的脂质含量进行了定量检测，结果发现，与处于萌发初始阶段的稻瘟病菌分生孢子相比，萌发6 h的稻瘟病菌分生孢子中有170种脂质的含量发生变化，其中99种下降，71种上升。本研究建立的检测方法使用毒性较小的甲基叔丁基醚代替了氯仿，使有机相从原来的下层变成了上层，在提取脂质过程中极大地减少了细胞碎片等杂质对纯化获得的脂质的污染，为稻瘟病菌以及其它物种脂质的定量检测提供参考。

Keywords: 非靶定量脂质组 search 超高效液相色谱-高分辨率串联质谱联用技术 search 稻瘟病菌 search 分生孢子 search

材料与试剂

  1. 直径为9 cm的培养皿
  2. 50 mL离心管（339652，Thermo ScientificTM）
  3. 滤布（Miracloth；Millipore, catalog number: 475855-1R）
  4. 涂布棒（Disposable Cell Spreaders, catalog number: 65-1010，STERILE）
  5. 血球计数板（1103，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）
  6. 标准级显微镜盖玻片（10212222C，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）
  7. 稻瘟病菌菌株（野生型菌株B157由新加坡淡马锡生命科学研究院Naweed I. Naqvi实验室惠赠）
  8. 疏水玻片（Microscope Cover Glass；fisherbrand, catalog number: 12541005）
  9. 内标物质包括：5 μg/mL的硬脂酸-d35（货号C117066，记作FA 18:0-d35）购自C/D/N Isotopes Inc（Pointe-Claire，Quebec，Canada）；2 μg/mL的LPC 18:1-d7（1-油酰基(d7)-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；货号791643C）、2 μg/mL的LPE 18:1-d7（1-油酰基(d7)-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；货号791644C）、5 μg/mL的PC 15:0-18:1-d7（1-十五烷酰基-2-油酰基(d7)-sn-甘油-3-磷酸胆碱；货号791637C）、5 μg/mL的PE 15:0-18:1-d7（1-十五烷酰基-2-油酰基(d7)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；货号791638C）、5 μg/mL的PG 15:0-18:1-d7（1-十五烷酰基-2-油酰基(d7)-sn-甘油-3-磷酸甘油；货号791640C）、2 μg/mL的SM d18:1-18:1-d9（N-油酰基(d9)-D-赤型鞘氨酰基磷酰胆碱；货号 791649C）和5 μg/mL的TAG 15:0-18:1-d7-15:0（1,3-双十五烷酰基-2-油酰基(d7)-甘油；货号791648C）购于Avanti Polar Lipids（Alabaster，Alabama，USA），所有内标物质的溶剂均为二氯甲烷/甲醇（1:1，v:v）混合液
  10. 甲醇（Methanol，MeOH；天津市百世化工有限公司）
  11. 甲基叔丁基醚（Methyl tert-butyl ether，MTBE；天津市永大化学试剂有限公司）
  12. 二氯甲烷（Merck，货号：75-09-2）
  13. 甲酸铵（Merck，货号：540-69-2）
  14. 甲酸（Formic acid；天津市科密欧化学试剂有限公司）
  15. 异丙醇（Isopropyl alcohol，IPA；天津市富宇精细化工有限公司）
  16. 乙腈（Acetonitrile；天津市永大化学试剂有限公司）
  17. Prune-agar（PA）固体培养基配方（1 L）(见溶液配方)
  18. 10 mmol/L甲酸铵溶液（1 L）(见溶液配方)
  19. 0.1%甲酸水溶液（1 L）(见溶液配方)
  20. 75%酒精溶液（1 L）(见溶液配方)

仪器设备

  1. GR60DA立式高压灭菌锅（ZEALWAY）
  2. 超净工作台（ESCO，ACB-4A1）
  3. 人工气候箱（宁波莱福科技有限公司）
  4. 冷冻高速离心机（Sorvall Legend Micro 17R，Thermo Fisher）
  5. 翻转式实验室摇床（ROCKER 2D，IKA）
  6. 样品冷冻研磨仪器（LUKYM-I，广州露卡测序仪器有限公司）
  7. 通风柜（FUME HOOD，上海正申实验室设备有限公司）
  8. 氮吹仪（NDK200-2N，杭州米欧仪器有限公司，MIULAB）
  9. 超高效液相色谱-高分辨串联质谱联用仪：赛默飞世尔公司Ultimate 3000超高效液相色谱仪（UHPLC）和Q Exative四极杆-静电场轨道阱质谱仪（简写QE）

实验步骤

Copyright: © 2025 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：刘俏, 龙茹慧, 梁志彬, 邓懿祯. (2025). 稻瘟病菌分生孢子非靶定量脂质组的样品制备与检测方法. // 微生物组实验手册. Bio-101: e1011019. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011019.
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How to cite: Liu, Q., Long, R. H., Liang, Z. B. and Deng, Y. Z. (2025). Sample Preparation and Detection Methods for Nontargeted Quantitative Lipidomics with Magnaporthe oryzae Conidia. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e1011019. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011019.
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