摘要: 目的:通过在光敏芯片上固定未经过修饰的石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)以及使用SPR样品回收技术(SPR recovery)垂钓与Hup A具有相互作用的潜在靶标。方法:通过紫外活化将Hup A固定在光敏芯片上,使用纯的乙酰胆碱酯酶(AChE)验证SPR样品回收技术的可行性;使用总蛋白裂解液进行SPR回收,将回收的样品冷冻干燥浓缩,进一步进行WB、银染和质谱检测。结果:银染可检测到SPR样品回收得到的纯AChE;质谱鉴定中未能检测到Hup A的靶标AChE,但是鉴定到Thbs1和Tubb5等影响细胞增殖、分化和细胞程序性死亡相关的潜在靶标。
结论:本文使用紫外产生自由基的原理将未修饰的Hup A固定在光敏芯片上,结合SPR 样品回收技术垂钓到Hup A的潜在靶标,方法可应用于寻找小分子的潜在作用靶标。
材料与试剂
- 光敏芯片 (Xantec,产品目录号: UVHC1000M)
- 石杉碱甲(MCE,产品目录号:HY-17387)
- 乙酰胆碱酯酶活性检测试剂盒(索莱宝,产品目录号:BC2025)
- 50 mM NaOH (泰坦生物, 产品目录号: 1310-73-2)
- Tris (泰坦生物, 产品目录号: 77-86-1)
- 三色预染蛋白(白鲨生物,产品目录号:BL742A)
- 4~20%梯度胶(碧云天生物,产品目录号:P0050A)
- 快速转膜液(碧云天生物,产品目录号:P0575-10L)
- 快速电泳液(碧云天生物,产品目录号:P0562-10L)
- Anti-AChE 抗体(生工生物,产品目录号:D194874)
- HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(生工生物,产品目录号:D110058)
- HRP显影液(美仑生物,产品目录号:MA0186-2)
- 考马斯亮蓝染液R250(考染)(生工生物,产品目录号:6104-59-2)
- 快速银染试剂盒(银染)(碧云天,产品目录号:P0017S)
- BCA试剂盒(碧云天生物,产品目录号:P0012S)
- Pierce® IP Lysis Buffer (Thermo,产品目录号:87787)
- 1.5 mL离心管(Axygen,产品目录号:MCT-150-C)
- T25培养瓶(Thermo,产品目录号:156367)
- T75培养瓶(Corning,产品目录号:430641)
- 高糖DMEM培养基(上海源培生物,产品目录号:M211125)
- FBS(澳范,产品目录号:FBSKM0502)
- 青霉素链霉素(上海源培生物,产品目录号:F121107)
- L-丙氨酰谷氨酰胺溶液(上海源培生物,产品目录号:39537-23-0)
- 0.25% Trypsin-EDTA(1×)(Gibco,产品目录号:25200-072)
- 10× PBS(Cytiva,产品目录号:BR100672)
- 10× HBS-EP(Cytiva,产品目录号:BR100669)
- 1× HBS-EP(见溶液配方)
- Pierce® IP Lysis Buffer(见溶液配方)
- 1× PBS(见溶液配方)
仪器设备
- Biacore T200(Cytiva,产品型号:T200)
- 电泳仪电源(BIO-RAD,产品型号:PowerPacTM Basic)
- Amersham生物分子成像仪(Cytiva,产品型号: ImageQuantTM 800)
- 冷冻干燥机(宁波新芝生物,产品型号:SCIENTZ-12N)
- LED紫外线灯(深圳中联,产品型号:365 nm,10 W)
- 多功能酶标仪(BMG LABTECH,产品型号:PHERAstar FSX)
- 质谱(Thermo Scientific,产品型号:Orbitrap Fusion Lumos)
实验步骤
Copyright: © 2024 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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