研究背景

表面等离子共振法是法规认可的药物活性评价技术，于2016年收录于美国和日本药典，2020年收录于中国药典。该方法是基于SPR原理：光透过棱镜照射到芯片上，光子与芯片表面的自由电子发生表面等离子共振，在反射光接收的某个角度能检测到能量损失，其对应的角度叫SPR角，研究表明SPR角的改变和芯片表面的质量变化成正比。利用表面等离子共振仪可以实时、原位测量各种生物分子的相互作用，得到亲和力、动力学、活性浓度等信息，广泛应用于药物靶点发现、药物筛选、分子垂钓、药物一致性评价、生产质控等，具有高灵敏、非标记、样品用量少、实时监测等优点。利用表面等离子共振仪Biacore T200的Inject and recover方法，可以对中草药提取液进行分子垂钓，以发现其潜在的活性成分，用于进一步的药物研发以及药理机制研究。
Hsp60是一种分子量为60 kDa的热休克蛋白，在神经保护作用方面发挥着重要作用。本实验选择Hsp60作为靶蛋白，通过Inject and recover的实验方法对药用植物苏木提取液的活性成分进行了分子垂钓，并对垂钓出的小分子化合物和Hsp60的结合进行了验证。

材料与试剂

1. 药用植物苏木提取液 (北京大学药学院屠鹏飞教授课题组生产制备，产品目录号: PKU-MRCTCM-SC214-2008)
2. LB培养基 (北京百奥莱博科技有限公司, 产品目录号: GS5031)
3. 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG，生工生物工程上海股份有限公司，产品目录号: A100487)
4. Ni-NTA纯化树脂试剂盒 (CWBIO，产品目录号: CW0894S)
5. 超滤管 (Millipore，产品目录号: Amicon Ultra-0.5，截留分子量10 kDa)
6. S系列CM5芯片 (Cytiva, Series S Sensor Chip CM5, 产品目录号: 29149603)
7. 氨基偶联试剂盒 (Cytiva, 产品目录号: BR100050)
8. 醋酸钠缓冲液 (Cytiva, Acetate 4.5, 产品目录号: BR100350; Acetate 4.0, 产品目录号: BR100349)
9. 96孔板 (Cytiva, 产品目录号: BR100503)
10. 96孔板封膜 (Cytiva，产品目录号: 28975816)
11. 10×PBS-P缓冲液 (Cytiva，产品目录号: 8995084)
12. 50 mM NaOH溶液 (Cytiva，产品目录号: BR100358)
13. 1.5 mL EP管 (KIRGEN，产品目录号: KG2211)
14. 1,000 mL 0.2 μm NY过滤器 (康宁，产品目录号: 430515)
15. 4.0 mL玻璃瓶 (Cytiva，产品目录号: BR100209)
16. 橡胶盖 (Cytiva，产品目录号: BR100411)
17. 0.2 µm滤膜 (PALL，产品目录号: FG8114)
18. 2 mL注射器 (上海治宇医疗器械有限公司，产品目录号: JQ4150002)
19. 三氟乙酸 (TFA，Alfa，HPLC Grade，产品目录号: 044630)
20. 碳酸氢铵 (NH₄HCO₃ Sigma-aldrich，产品目录号: 09830)
21. 二甲基亚砜 (DMSO，MP，产品目录号: 196055)
22. 咪唑（Sigma-aldrich，产品目录号: 56748）
23. 1× PBS-P缓冲液（见溶液配方）
24. 中草药提取液（见溶液配方）
25. 0.5% TFA水溶液（见溶液配方）
26. 50 mM 碳酸氢胺水溶液（见溶液配方）
27. 中药活性小分子化合物母液（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 纯水仪 (密理博, model: Milli-Q Integral)
2. 表面等离子共振仪 (Cytiva, model: Biacore T200)
3. 台式离心机 (贝克曼, model: Microfuge 20)
4. 循环水多用真空泵 (郑州特尔仪器设备有限公司, model: SHZ-D(III))
5. 摇床 (Thermo Scientific, model: SHKE8000)
6. 超声破碎仪 (Sonica, model: q700)
7. 制冰机 (雪科电器有限公司，model: CK2021010042)
8. 蛋白定量仪 (Denovix，model: DS-11)
   

实验步骤