Screening of Active Ingredients from Chinese Herbs Based on Lentiviral Particles immobilized Surface Plasmon Resonance

研究背景

膜蛋白是重要的药物靶点，在多种生物过程中均起到关键作用。由于膜蛋白离开磷脂双分子层环境会导致其蛋白构象和活性受到不可逆的破坏，目前针对膜蛋白的药物开发是一项具有挑战性的工作，虽然已有生物亲和质谱[1]、细胞膜色谱[2]等多种技术被应用于针对膜蛋白筛选化合物，然而这些技术在专属性、灵敏度、通量和操作的简便性上仍无法完全满足膜蛋白药物筛选的要求。因此，新型膜蛋白药物筛选技术仍然药物开发的技术难点，建立合适的膜模拟系统来维持膜蛋白的活性和构象具有重要意义[3]。
由于具有专属性强、灵敏度高等优势，SPR传感器已成为研究膜蛋白与药物分子之间相互作用的有效工具。但由于膜蛋白的特殊性，在进行SPR膜蛋白研究中需要对膜蛋白分子进行稳定化[4]。目前，通常通过人为构建类似于细胞膜的亲脂环境稳定膜蛋白，并将其偶联于SPR芯片表面[5]。可通过使用去垢剂[6]，脂质体[7]和纳米磷脂盘来人为构建类似生物膜的亲脂环境。这种方法有许多成功的研究案例，但同时也存在一些局限性：首先，在稳定化过程中膜蛋白需要离开其天然脂质环境，这会严重影响膜蛋白的构象和活性；此外，该方法需要对膜蛋白进行标记，这可能会影响膜蛋白的活性甚至与化合物的结合；最后，优化膜蛋白稳定条件是一项费时费力的工程。上述的局限性制约了此类方法的应用。
使用慢病毒颗粒作为膜蛋白的载体，将目的基因插入慢病毒转染所需的质粒中，从而获得细胞膜上的膜蛋白。通过选择质粒并引入内部启动子和增强子元件，调节目标基因的表达水平和稳定性，确保基因表达受控，再通过基因组编辑技术，实现外源基因在宿主基因组中的精确整合，提高安全性。这种策略具有高专属性、高灵敏度和高通量的优点。慢病毒载体稳定技术可用于稳定表达跨膜蛋白等多次跨膜蛋白靶点的研究，以及基因治疗和药物开发。
本试验方案以膜蛋白CXCR4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）为例，采用基于慢病毒载体的膜蛋白稳定策略，将携带膜蛋白的慢病毒偶联在SPR传感芯片表面，构建成基于SPR的活性药物筛选系统，通过Biacore T200系统和高分辨质谱系统，对3种中药进行活性成分筛选、分析与鉴定，最终在川芎中筛选得到活性成分洋川芎内酯I，并确证了其亲和力和生物活性[8, 9]。这种基于慢病毒的稳定策略利用了从宿主细胞中产生的慢病毒在离开宿主细胞体内时，会整合宿主细胞的细胞膜片段，并同时携带细胞膜上的蛋白质的原理，具有其独特的优势：（1）高活性，膜蛋白无需离开其天然脂质环境，可以保持结构和活性；（2）无标记，LVPs表面上有多种蛋白，可以利用氨基偶联法直接偶联在芯片上而无需其他标记；（3）操作简便，慢病毒易于制备和纯化，且具有一定刚性、对操作条件要求不高。因此，慢病毒载体结合SPR技术在活性化合物筛选方面展示出巨大的潜力。

材料与试剂

1. CM5芯片（Cytiva，catalog number: 29104988）
2. 氨基偶联试剂盒（Cytiva，catalog number: BR100633
3. 10 mM醋酸钠缓冲液pH 4.0–5.5（Cytiva，catalog number: BR100349-52）
4. 50 mM NaOH溶液（Cytiva，catalog number: BR100358）
5. 10× HBS-EP+（Cytiva，catalog number: BR100669）
6. 10× PBS buffer（Cytiva，catalog number: BR100672）
7. 三氟乙酸（Adamas，catalog number: 81548K）
8. 碳酸氢铵（Sigma-Aldrich，catalog number: 09830-500G）
9. XBridge BEH C18色谱柱（130Å，2.5 µm，2.1 mm × 100 mm）（Waters，catalog number: 186006031）
10. 质谱纯甲醇（Supelco，catalog number: MX0490）
11. 质谱纯乙腈（Sigma-Aldrich，catalog number: L010100）
12. 质谱纯甲酸（Supelco，catalog number: FX0450）
13. 川芎药材（产自四川彭州，2017年）、穿心莲药材（产自广西贵港，2017年）、苦楝子药材（产自河北保定，2017年），均购买于上海长海医院
14. HEK293T细胞株（中国科学院上海分院细胞库）
15. 胎牛血清（Gibco，catalog number: A5256801）
16. 胰酶（Gibco，catalog number: 25200072）
17. RPMI-1640培养基（Gibco，catalog number: 11875101）
18. 青霉素与链霉素（Gibco，catalog number: 15140148）
19. 质粒设计并合成（吉玛基因公司）
20. JetPEI转染试剂（Polyplus，catalog number: 101000053）
21. 聚乙二醇8000（Sigma-Aldrich，catalog number: P2139）
22. CXCR4一抗（Abcam，catalog number: ab124824）
23. GAPDH一抗（Abcam，catalog number: ab8245）
24. P24一抗（Abcam，catalog number: ab65289）
25. 醛/硫酸盐乳胶微珠（Thermo Scientific，catalog number: A37304）
26. 小鼠二抗（Licor，catalog number: 926-32210）
27. 兔二抗（Licor，catalog number: 926-32211）
28. AMD3100（MCE, catalog number: HY-10046）
29. 吉非替尼（MCE, catalog number: HY-50895）
30. Stattic（MCE, catalog number: HY-13818）
31. 洋川芎内酯I（美仑生物，catalog number: 94596-28-8）
32. Transwell 聚酯膜小室（Corning，catalog number: 3470）
    

仪器设备

1. 生物安全柜（Thermo，model: 1300 series A2）
2. 生化培养箱（Thermo，model: Heracell 150i GP）
3. 蛋白质成像系统（Licor，model: Odyssey）
4. 流式细胞仪（Becton Dickinson，model: BD FACS Celesta）
5. 相互作用分析仪（Cytiva，model: Biacore T200）
6. 液相色谱系统（Agilent，model: Agilent 1290 Infinity LC）
7. 飞行时间质谱仪（Agilent，model: Agilent 6538 UHD Q-TOF MS）
8. 超纯水制备系统（Millipore，model: Milli-Q A10）
   

实验步骤