研究背景

目前有很多方法可以用来研究RNA与蛋白之间的相互作用，包括电泳迁移率测定、RNA pull down、RNA足迹、RNA免疫沉淀、紫外线诱导交联免疫沉淀等[3]。这些方法虽然在很多方面能够解决RNA与蛋白之间的相互作用分析问题，但都存在步骤繁琐、耗时费力、检测弱相互作用能力弱、信息量偏少等缺点。为了验证ssRNA-m6A和SRSF7之间的直接结合，我们利用表面等离子体共振（SPR）技术分析它们之间的相互作用。SPR检测技术具有实时检测、高效快速、亲和力测试动态范围宽等特点，可以获得RNA与蛋白之间亲和力常数等全面的互作信息。
Biacore是基于SPR技术来实时跟踪记录生物分子间相互作用的表面等离子共振仪。SPR检测原理是光在棱镜与金属膜表面发生全反射现象时会形成消逝波进入金属介质，而在金属介质内存在表面等离子波，当消逝波与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子体共振。发生SPR时，入射光能量被表面等离子体吸收，使反射光的能量急剧减少甚至接近为0。这种最小化发生时的入射光角度称为 SPR 角。分子间的结合/解离造成金膜附近折光率的实时变化，导致SPR角的变化，这一现象被Biacore实时记录。
Biacore检测RNA与蛋白之间相互作用的原理为生物素标记的ssRNA-m6A和ssRNA可以偶联在含有链霉亲和素的SA芯片上，偶联在芯片上的分子称为配体分子。链霉亲和素-生物素是自然界中最强的非共价相互作用之一，生物素标记的配体分子可以稳定的结合在SA芯片上而不被洗脱。当分析蛋白分别流过偶联了ssRNA-m6A和ssRNA芯片时，若蛋白与ssRNA-m6A或ssRNA有相互作用，则蛋白结合在芯片上，导致SPR角的变化，仪器产生上升的响应信号。当分析蛋白停止流过芯片时，由于蛋白与RNA形成自发解离，仪器产生下降的响应信号。因此Biacore可以获取RNA与蛋白反应过程中它们相互作用的特异信号，从而实现相互作用的实时动态检测。
本文描述的方法适用于所有生物素标记的RNA与蛋白之间的相互作用研究，经过简单优化也适用于DNA与蛋白之间的相互作用研究。比如在DNA与蛋白的相互作用测试时，缓冲液和样品都不需要添加RNase Inhibitor，溶液配制不需要DEPC 水，只需超纯水。总之，Biacore 8K具有高通量、高灵敏度、实时监测等特点，特别适合核酸与蛋白的相互作用检测。

材料与试剂

1. 重组SRSF7蛋白（上海交通大学系统院陶生策课题组制备）
2. S系列SA芯片 (Cytiva, Series S Sensor Chip SA, 产品目录号: BR100531)
3. ssRNA: Biotin-5'-CGUCUCGGACUCGGACUGCU-3'；
4. ssRNA-m6A: Biotin-5'-CGUCUCGG(m6A)CUCGG(m6A)CU-3'（金斯瑞公司合成，南京, 中国)
5. 96孔板 (Cytiva, 产品目录号: BR100503)
6. 96孔板封膜 (Cytiva，产品目录号: 28975816)
7. 10× HBS-P缓冲液 (Cytiva，产品目录号: BR100671)
8. 50 mM NaOH溶液 (Cytiva，产品目录号: BR100358)
9. 1.5 mL EP管 (Axygen，产品目录号: BCT-150-C)
10. NaOH固体（Cytiva，产品目录号：306576）
11. NaCl 固体（Sigma，产品目录号：S7653）
12. 异丙醇（CNW，产品目录号：CAEQ-4-013493-4000）
13. RNase Inhibitor（翌圣, 产品目录号：10701ES10)
14. DEPC水（Sigma，产品目录号：693520）
15. 1.0× HBS-P缓冲液 (见溶液配方)
16. 配体分子母液 (见溶液配方)
17. SRSF7蛋白母液 (见溶液配方)
18. 5 M NaCl (见溶液配方)
19. 1 M NaOH 溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 纯水仪 (密理博，Milli Q)
2. 表面等离子共振仪 (Cytiva，Biacore 8K)
3. 台式离心机 (赛默飞，Micro21R)
   

实验步骤