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糖基化修饰对新型冠状病毒S蛋白与ACE2相互作用的影响(SPR法)

The Effect of Different Glycosylation Modifications on the Interaction between SARS-CoV-2 S and ACE2 (SPR)

侯 侯敬丽
汤 汤玉
叶 叶发荣

发表时间: 2024年04月08日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1011007 浏览次数: 1374

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表面等离子体共振（SPR）技术实验手册
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摘要: SARS-CoV-2通过刺突蛋白（S）的受体结合域（RBD）附着到其宿主受体血管紧张素转换酶2（ACE2）上。RBD是开发抗SARS-CoV-2中和抗体和疫苗的关键靶点。然而，SARS-CoV-2的S蛋白被高度糖基化，RBD包含两个高度可变的n链聚糖（N331，N343）和两个可能的低丰度O-链聚糖[1,2]。糖基化的S蛋白通过屏蔽免疫原性表位对中和抗体的影响，促进免疫逃避，从而影响疫苗诱导的免疫应答。考虑到不同糖型的微观异质性所引发的不同的药效学和生物学特性，非常有必要理解RBD上每个糖基化位点的聚糖结构与其功能之间的精确相关性。
在本实验案例中，我们利用含有特定均一结构糖型的RBD蛋白质，使用表面等离子共振仪Biacore 8K对这些不同糖型的RBD分别与ACE2和临床获批的中和抗体进行亲和力和动力学检测[3]。结果发现RBD糖基化的大小对其与ACE2的结合没有明显影响。与临床获批的中和抗体（S309, AS35）结合力测试表明如果抗体靶点为非糖基化区域，病毒糖基化造成的免疫逃逸效应不明显。高度保守的以海藻糖为核心的N343糖基化修饰部位是S309识别的主要表位之一[4]，与WT-RBD相比，合成的RBD与S309结合的亲和力显著降低，表明缺乏海藻糖的RBD 显著降低了中和抗体的敏感性。以上结果表明Biacore 8K可以帮助我们更为深入了解病毒糖基化的作用，有助于抗体药物研发以及疫苗设计。

Keywords: 表面等离子共振仪 search 糖基化修饰RBD search ACE2 search 中和抗体 search Biacore search

材料与试剂

  1. 糖基化修饰RBD (合成方法参照文献Ye et al. [3]，上海交通大学化学化工学院王平教授课题组制备，上海交通大学分析测试中心完成糖基化修饰信息分析，图1)


    图1 合成的不同糖基化修饰的RBD蛋白结构示意图[3]

  2. ACE2配体蛋白 (ACROBiosystems，产品目录号: AC2-H5257)
  3. 中和抗体AS35 (ACROBiosystems, anti-SARS-CoV-2 spike RBD neutralizing antibody, Human IgG1, 产品目录号: SAD-S35)
  4. 中和抗体S309 (合成方法参照文献Li et al. [5]，复旦大学应天雷教授课题组制备)
  5. WT-RBD (ACROBiosystems, Arg319-Lys537 with His Tag，产品目录号: SPD-C52H1)
  6. S系列Protein A芯片 (Cytiva, Series S Sensor Chip Protein A，产品目录号: 29127556)
  7. 96孔板 (Cytiva, 产品目录号: BR100503)
  8. 96孔板封膜 (Cytiva，产品目录号: 28975816)
  9. 10× HBS-EP缓冲液 (Cytiva，产品目录号: BR100669)
  10. Glycine 1.5缓冲液 (Cytiva，产品目录号:BR100354)
  11. 1.5 mL EP管 (Axygen，产品目录号: BCT-150-C)
  12. ZebaTM 脱盐离心柱 (Thermofisher，产品目录号：89882)
  13. 1.0× HBS-EP缓冲液 (见溶液配方)
  14. 配体蛋白母液 (见溶液配方)
  15. 不同糖基化修饰的RBD蛋白母液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 纯水仪 (密理博, Milli Q)
  2. 表面等离子共振仪 (Cytiva, Biacore 8K)
  3. 台式离心机 (赛默飞, Micro21R)

实验步骤

Copyright: © 2024 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：侯敬丽, 汤玉, 叶发荣. (2024). 糖基化修饰对新型冠状病毒S蛋白与ACE2相互作用的影响(SPR法). // Surface Plasmon Resonance (SPR) Protocol eBook. Bio-101: e1011007. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011007.
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How to cite: Hou, J. L., Tang, Y. and Ye, F. R. (2024). The Effect of Different Glycosylation Modifications on the Interaction between SARS-CoV-2 S and ACE2 (SPR). // Surface Plasmon Resonance (SPR) Protocol eBook. Bio-101: e1011007. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011007.
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