引言

在新冠疫情中，中和抗体作为被动免疫治疗的手段之一已被广泛研究，抗体对抗原的亲和力是其有效性的关键因素，因此研究抗体与抗原的亲和力具有重要意义。检测抗体与抗原亲和力的方法有多种，例如表面等离子共振技术（SPR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和生物层析技术等。尽管这些方法都有其用途，但SPR技术在检测抗体与抗原亲和力方面具有独特的优势。SPR技术通过监测生物分子在金属表面上的相互作用引起的表面等离子共振现象，实时监测它们的结合与解离过程，从而得到抗原与抗体的亲和力和动力学参数。这对于理解抗体-抗原相互作用的复杂性非常重要，可以为设计更有效的治疗药物提供关键信息。因此，SPR技术在抗原抗体亲和力测定中被广泛应用，并被认为是一种高度准确的方法。
SARS-CoV-2新冠病毒表面具有糖基化的刺突蛋白(spike protein, S)，位于S蛋白上的受体结合区域（RBD）能与宿主细胞受体蛋白ACE2相互作用并触发膜融合，因此阻断RBD与ACE2的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。靶向RBD区域的中和抗体可通过阻断RBD与受体ACE2的结合起到抗病毒作用。
纳米抗体(nanobody)，又称单域抗体 (single-domain antibody, VHHs)，是来自骆驼科动物重链抗体的单域可变区 (single-domain variable regions)。纳米抗体通常可以获得与常规抗体相当的抗原亲和力特性，同时又具有分子量小(~15 kDa)、免疫原性低、更好的溶解度和稳定性、较长的CDR3区等优点，多株靶向RBD的纳米抗体已被分离和鉴定，并表现出良好的体内外抗病毒活性。
在我们的前期研究中报道了两株纳米抗体R14和S43[1]。在亲和力测试过程中，通过不同标签来标记蛋白进行固定时，获得的亲和力数据差异较大。我们期望通过这项研究，深入了解不同标签构建的抗原和抗体之间的亲和力差异及造成该现象的原因，为抗体药物的设计提供可靠的亲和力检测方法。

材料与试剂

1. pCAGGS载体（MiaoLingPlasmid，catalog number: P0165）
2. DMEM培养基（Invitrogen，catalog number: C11995500BT）
3. FBS（ANALYSIS QUIZ，catalog number: AQmv02200）
4. SMM 293-TII Expression Medium（SinoBiological，catalog number: M293TII-1L）
5. Sinofection Transfection Reagent（SinoBiological，catalog number: STF02-5ML）
6. SMS 293-SUPI cell culture supplement（SinoBiological，catalog number: M293-SUPI-100 mL）
7. HEK293F细胞（Gibco，catalog number: 11625-019）
8. HEK293T细胞（ATCC，catalog number: CRL-3216）
9. Polyethylenimine（PEI）（Yeasen，catalog number: 40816ES03）
10. HisTrap HP 5 mL column（Cytiva，catalog number: 17524802）
11. HiLoad 16/600 Superdex 200 pg（Cytiva，catalog number: 28989335）
12. NHS-PEG12-Biotin生物素（Thermo Scientific，catalog number: 21312）
13. 超滤管15 mL 10KD（Merck millipore，catalog number: UFC901096）
14. 超滤管15 mL 30KD（Merck millipore，catalog number: UFC903096）
15. Series S Sensor Chip SA（Cytiva，catalog number: 29104992）
16. Series S Sensor Chip Protein A（Cytiva，catalog number: 29127556）
17. BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，catalog number: P0010）
18. 含有20% FBS的DMEM培养基（见溶液配方）
19. 10× PBS储备液（见溶液配方）
20. 1× PBS工作液（见溶液配方）
21. PBST（0.05% Tween-20）（见溶液配方）

仪器设备

1. 仪器型号：Biacore 8K
2. 芯片类型：SA和protein A
3. 低温离心机（Oxford Lab Products，model: OD-16R）
4. 超速离心机（Himac，model: CR22N）
5. 二氧化碳恒温摇床（精骐，model: IS-9CT）
6. 二氧化碳培养箱（Thermo，model: 371）
7. 显微镜（OLYMPUS，model: CKX31）
8. 生物安全柜（哈东联，model: Ⅱ级A2）
9. 蛋白纯化系统（GE Healthcare，model: ÄKTATM pure）
10. 微量分光光度计（奥盛，model: Nano-300）
11. 电泳仪（君意，model: JY300HE）
12. 脱色摇床（欧诺，model: HNY-903H）
13. 酶标仪（TECAN，model: INFINITE M200 PRO）
14. 分子相互作用分析仪（GE Healthcare，model: Biacore 8K）
    

实验步骤