Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

食蟹猴超数排卵与卵母细胞采集流程

Superovulation and Oocyte Collection

王 王燕
许 许玉婷
李 李春杨
孙 孙强

发表时间: 2022年03月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010982 浏览次数: 1509

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实验动物胚胎操作实验手册
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摘要：卵泡和卵母细胞的发育与成熟要经过极其复杂的生理过程，整个过程需要受内分泌激素和细胞因子等多个系统的调节。并且在食蟹猴的每个生理周期，自然成熟的卵母细胞仅1-2枚，远不能满足基因编辑等实验研究的需求。因此，需要对实验猴采用超数排卵的方法获取大量成熟的卵母细胞，用于实验研究。应用外源促性腺激素诱发母猴卵巢的多个卵母细胞同时发育到成熟卵泡，然后利用手术的方法获得成熟或接近成熟的卵母细胞的方法称为超数排卵，简称“超排”。超数排卵是辅助生殖技术的关键环节，最早，研究者采用来自体内的激素，如从绝经期妇女的尿液和血液中提纯的促性腺激素等，成功进行了猴超数排卵研究。但是，这些天然激素具有较高的免疫源性，且含促黄体激素，常常影响超排效果和动物重复利用价值。重组人促性腺激素是20世纪80年代末开始用于人类辅助生殖的首选药品，它是利用生物技术合成的生物制剂，给辅助生殖带来很好的超排结果；降低了猴的应激反应，并增加动物的重复利用率。但是，其价格昂贵，国际上仅有几家生产商的产品被认可。在常规超排中，1只猴的激素药品费用大约在2500-3000元。
卵母细胞采集方法有手术取卵、腹腔镜系统取卵、超声介导下取卵，我们实验室利用腹腔镜系统进行取卵，因为腹腔镜手术创伤小，动物伤口愈合快，痛苦少，卵子采集比较彻底，术后动物腹腔几乎不会粘连。

Keywords: 激素 search 超数排卵 search 腹腔镜 search 食蟹猴 search

材料与试剂

试剂

  1. NaCl（Sigma-Aldrich，catalog number：S7653）
  2. KCl（Sigma-Aldrich，catalog number：P5405）
  3. CaCl2·2H2O（Sigma-Aldrich，catalog number：C7902）
  4. MgCl2·6H2O（Sigma-Aldrich，catalog number：M2670
  5. NaH2PO4（Sigma-Aldrich，catalog number：S8282）
  6. NaHCO3（Sigma-Aldrich，catalog number：S5761）
  7. HEPES（Sigma-Aldrich，catalog number：H3375）
  8. D-Glucose（Sigma-Aldrich，catalog number：G7528）
  9. Sodium Pyruvate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5280）
  10. Sodium lactate (60% syrup)（Sigma-Aldrich，catalog number：L4263）
  11. BSA（absin，catalog number：abs9156）
  12. Penicillin-streptomycin (100X)（gibco，catalog number：15070-063）
  13. Calcium lactate pentahydrate（Sigma-Aldrich，catalog number：C8356）
  14. Glutamine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8540）
  15. Phenol Red（Sigma-Aldrich，catalog number：P0290）
  16. Estradiol（Sigma-Aldrich，catalog number：E2758）
  17. FBS（gibco）
  18. CMRL Medium 1066（gibco，catalog number：11530-037）
  19. Progesterone（Sigma-Aldrich，catalog number：P6149）

一、超数排卵
  1. 1 ml带针头注射器（一次性）
  2. 氯化钠注射液/100 ml:0.9 g上海长征富民金山制药有限公司
  3. 重组人促卵泡激素注射液（果纳芬）450 IU/0.75 ml英国Merck Serono Europe Ltd.
  4. 重组人绒促性素注射液（艾泽）250 μg/0.5 ml 英国Merck Serono Europe Ltd.

二、腹腔镜系统取卵法

  1. 15 ml 离心管（Corning，catalog number：430791）
  2. 18-G 卵泡吸取针（Olympus，catalog number：G19715）
  3. 移液枪 (Eppendorf)
  4. 40 μm 过滤器（FALCON，catalog number：352340）
  5. 口吸管（北京正天，catalog number：BJ-40）
  6. 不可吸收缝合线（2-0）
  7. 可吸收性外科缝线（3-0）
  8. 手术器械包（抓钳、气腹针、戳卡、眼科剪、镊子、持针钳、止血钳、圆针、三棱针。以上物品高压灭菌备用。）
  9. 3.5 cm培养皿（Coring，catalog number：430165）
  10. 6 cm培养皿（Coring，catalog number：430166）
  11. 10 cm培养皿（Coring，catalog number：430167）
  12. 75%酒精
  13. 碘酒
  14. 舒泰 50 维克贸易（上海）有限公司3597133073812
  15. 硫酸阿托品注射液（上海禾丰制药有限公司）
  16. 注射用青霉素钠/80万单位 华北制药股份有限公司
  17. 布洛芬
  18. 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）
  19. 肝素钠（上海三杰，catalog number：091201）
  20. Hyaluronidase（Sigma，catalog number：H3884）
  21. 高纯氮
  22. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) （见溶液配方表1）
  23. CMRL-1066（见溶液配方表2）

仪器设备

一、超数排卵

  1. 4°冰箱
  2. B超仪ACUSON NX3 Elite西门子

二、腹腔镜系统取卵法

  1. 气腹机（OLYMPUS UHI-3）
  2. 高辉度光源装置（OLYMPUS CLH-250）
  3. 振荡器（Kylin-Bell Lab Instruments, catalog number：QH-600）
  4. 负压吸引泵（Cook K-MAR-5200）
  5. 管式加热器（Cook）
  6. 体视显微镜（Olympus，model：SZX7）
  7. 培养箱（Thermo Scientific，model：Forma 3111、Forma 371）
  8. 摄像系统（OLYMPUS OTV-SC2）
  9. 显示屏（SONY）

实验步骤

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：王燕, 许玉婷, 李春杨, 孙强. (2022). 食蟹猴超数排卵与卵母细胞采集流程. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010982. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010982.
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How to cite: Wang, Y., Xu, Y. T., Li, C. Y., and Sun, Q. (2022). Superovulation and Oocyte Collection. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals. Bio-101: e1010982. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010982.
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