研究背景

在脑科学研究中，常常需要对脑组织切片进行免疫荧光染色来检测基因表达或鉴别细胞类型。免疫荧光染色的基本原理为：以带荧光的特异性抗体在组织细胞原位反应形成抗原—抗体复合物，进而通过相应波长的激光激发荧光色素，可观察到目的蛋白的表达情况。
免疫荧光染色法分为直接法和间接法两种。前者令荧光基团标记的已知抗体直接与细胞或组织内的特定抗原结合；后者先用无标记的一抗识别细胞或组织内的特定抗原，再令荧光基团标记的二抗识别特定种属的一抗，形成抗原-抗体-抗体复合物。二者相较，间接法有助于信号放大，敏感性强，应用广泛（Im et al., 2019）。本文所述为间接法。
为便于抗体渗透和成像观察，在免疫染色之前通常需要对多聚甲醛固定过的脑组织进行切片，常用方法包括石蜡切片、冰冻切片和振动切片。振动切片是在常温下通过振动切片机刀片的往复切削快速获得组织切片的一种实验操作。相比于石蜡切片和冰冻切片，它省却了脱水、透明、浸蜡或沉糖、冰冻等过程（Zhang and Xiong, 2014; 李贵苹等, 2015），较为简便，但切片的厚度一般不能低于30 μm（Zhang and Xiong, 2014）。根据组织的软硬程度和所需收集的切片位置与角度，在切片前可酌情进行琼脂糖包埋以增加硬度或扩大切片范围。本文所介绍的是针对固定后成年小鼠脑组织的振动切片及对漂浮状态的脑切片进行免疫荧光染色和封片的步骤。但是，免疫荧光染色与封片这两部分操作也适用于漂片法收集的冰冻切片。对于贴片收集的新鲜或固定后组织冰冻切片，因需直接在玻片上进行免疫染色，本指南中的大部分操作并不适用。

材料与试剂

1. 称量纸
2. 无尘擦拭纸（Kimtech）
3. 锡箔纸（佳能）
4. 自制包埋模具（自制包埋板20 × 12 cm；包埋支架三立面长1.4 cm，高0.6 cm，外侧线间距0.7 cm。空心长方体包埋模具，外尺寸2.5 × 2.5 × 2.6 cm，内尺寸2 × 2 × 2.6 cm。适用于成年小鼠脑组织包埋。见图1。）（Ragan et al., 2012）
   
   
   图1. 自制包埋模具
   （A）自制包埋板。尺寸20 × 12 cm。（B）包埋板的放大图，显示包埋板上的三片立面支架：长1.4 cm，高0.6 cm，间距0.7 cm。（C）空心长方体包埋模具。外尺寸2.5 × 2.5 × 2.6 cm，内尺寸2 × 2 × 2.6 cm。
   
   
5. 48孔板（路斯特，23048）（孔径16 mm，孔深17 mm）
6. 2 mL一次性塑料滴管（路斯特，13002）
7. 载玻片（世态，80312-3161）
8. 盖玻片（世态，80340 -3610）
9. 琼脂糖（TSINGKE，111860）
10. 双蒸水
11. 正常驴血清（蕊特生物，W9030-05）
12. Triton X-100（sigma，X100）
13. NaN₃（sigma，S2002）
14. ProClean 300（Beyotime，ST853）
15.  一抗
16. 荧光二抗（Thermofisher、Sigma或Jackson Lab）
17. DAPI（sigma，D9542）
18. 封片剂（SouthernBiotech0100-01；或LERNER LABORATORIES，13800）
19. 1× PBS（见溶液配方）
20. 封闭液（见溶液配方）

仪器设备

1. 25 mL量筒（蜀牛）
2. 50 mL锥形瓶（蜀牛）
3. 单面刀片（Leica，819）
4. 双刃刀片（Gillette，92359217）
5. 502胶水（得力）
6. 记号笔
7. 细毛笔（HWAHONG，345#1）
8. 无色透明指甲油（国产）
9. 体式荧光显微镜（Nikon，SMZ25）
10. 电子天平（上海恒平，MP3002）
11. 微波炉（Galanz，P70F23P-G5（SO））
12. 振动切片机（LEICA，VT1000S）
13. 1,000 μL移液枪（Eppendorf，3120000267）
14. 200 μL移液枪（Eppendorf，3120000259）
15. 10 μL移液枪（Eppendorf，3120000224）
16. 桌面离心机（Thermo Fisher，75002420）
17. 脱色摇床（QILINBEIER，TS-1）
    

实验步骤