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树鼩精原干细胞系的分离和建系培养

Establishment of Spermatogenic Stem Cell Lines from Tree Shrew

李 李聪*
毕 毕蕊*
郑 郑萍*

*Contributed equally to this work 发表时间: 2021年08月13日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010935 浏览次数: 1771

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实验动物胚胎操作实验手册
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摘要：树鼩与灵长类动物关系密切，在生物医学研究中比啮齿类动物有更多优势。然而，由于树鼩雌性生殖生物学基本知识如发情周期，体外胚胎培养周期和技术等的缺乏，从而阻碍了树鼩的广泛应用。基因操作方法的缺乏阻碍了树鼩的广泛应用。目前在小鼠和大鼠中精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)能够在体外长时间扩增培养，并且进行基因编辑。在这里，我们描述了一种分离、培养体系，能够进行树鼩精原干细胞(tree shrew spermatogonial stem cells，TS-SSCs)的长期体外扩增，并保持其干细胞的特性。在我们的研究中，我们使用THY1(CD90)抗体流式分选或磁珠分选、或者差异贴壁的方式来富集TS-SSCs。在原代培养过程中，培养基中添加一定浓度的wnt3a可以提高SSCs的存活率。使用树鼩支持细胞(tree shrew sertoli cells，TS-STO)作为饲养层对于TS-SSCs增殖是必要的。将TS-SSCs与基因编辑方法结合起来的培养系统的发展，为对树鼩进行精确的基因操作铺平了道路。

Keywords: 树鼩 search 精原干细胞 search 分离 search 细胞培养 search

材料与试剂

  1. 4月龄至3岁龄雄性树鼩
  2. 0.22 μm滤器 (Millipore, catalog number: SLGP033RB)
  3. 细胞滤网 (Falcon, catalog number: 352350)
  4. 15 ml离心管 (NEST, catalog number: 601052)
  5. 50 ml离心管 (NEST, catalog number: 602001)
  6. 24孔板 (Corning, catalog number: 3524)
  7. 培养皿 (60 mm) (Corning, catalog number: 430166)
  8. 磁力架 (Miltenyi/美天旎, catalog number: 130-042-301)
  9. 50 ml 注射器 (国产(经销), catalog number: ks001)
  10. 冻存管 (Nunc, catalog number: 375418)
  11. Trypsin-EDTA (0.25%)，phenol red (Thermo Fisher, catalog number: 25200072)
  12. Collagenase IV 胶原酶IV (Gibco, catalog number: 17104-019)
  13. DMEM，Powder，High Glucose，Pyruvate (Thermo Fisher, catalog number: 12800017)
  14. DNA酶I脱氧核糖核酸酶 (Sigma, catalog number: DN-25)
  15. Gibco PSN (Gibco, catalog number: 15640055)
  16. 明胶 (gelatin) (Amresco, catalog number: 9764-500 g)
  17. Stempro-34 SFM (1×)，liquid (Thermo Fisher, catalog number: 10639-011)
  18. FBS QUALIFIED AUSTRALIA ORIGIN 500 ml澳洲胎牛血清 (Thermo Fisher, catalog number: 10099141)
  19. 丙酮酸钠100 mM (Gibco, catalog number: 11360-070)
  20. MEM Non-Essential Amino Acids Solution，100× (Gibco, catalog number:11140-050)
  21. 牛血清白蛋白 (BSA) (Aladdin/阿拉丁, catalog number: 9048-46-8)
  22. 2-Mercaptoethanol for molecular biology, for electrophoresis, suitable for cell culture, BioReagent, 99% (GC/titration) (Sigma, catalog number: M3148-500 ml)
  23. L-谷氨酰胺 (Sigma, catalog number: 56-85-9)
  24. EGF (epidermal growth factor) (Life Technologies, catalog number: PHG0311)
  25. Recombinant Human GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) Protein, R&D Systems, catalog number: 212-GD-010)
  26. Mouse LIF (leukemia inhibitory factor)(Millipore, catalog number: ESG1107)
  27. bFGF (basic fibroblast growth factor) (Millipore, catalog number: GF003)
  28. rhWnt3a (R&D, catalog number: 5036-WN)
  29. Anti-PE micro beads (Miltenyi/美天旎, catalog number:130-048-801)
  30. PE Anti-human CD90 (THY1) (BioLegend, catalog number: 328110)
  31. 磁珠柱子MS-columns (Miltenyi/美天旎, catalog number: 130-042-201)
  32. 磁珠柱子LS-columns (Miltenyi/美天旎, catalog number: 130-042-401)
  33. Mitomycin C from Streptomyces caespitosus powder (Sigma, catalog number: M4287）
  34. 腐胺(putrescine) (Sigma, catalog number: V900377)
  35. TS-SSC培养基 (见溶液配方)
  36. 胶原酶Ⅳ (见溶液配方)
  37. DNA酶I脱氧核糖核酸酶 (见溶液配方)
  38. 明胶 (gelatin) (见溶液配方)
  39. Mitomycin C from Streptomyces caespitosus powder (20×) (见溶液配方)
  40. Glutamine (100×) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 流式细胞仪 (BD，型号：Influx)
  2. 恒温水浴锅 (北京水光明医疗器械，型号：001)
  3. 细胞培养箱 (Thermo Fisher ，型号：371 气套式)
  4. 倒置显微镜 (尼康，型号：TE2000)
  5. 超净工作台 (苏净集团安泰公司，型号：SW-CJ-2FD)
  6. 高温高压灭菌锅 (YAMATO，型号：全系列)
  7. 移液器/移液枪 (Eppendorf，型号Research plus)
  8. 超纯水系统 (Millipore，型号Milli-Q)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：李聪, 毕蕊, 郑萍. (2021). 树鼩精原干细胞系的分离和建系培养. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010935. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010935.
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How to cite: Li, C.,Bi, R. and Zheng, P. (2021). Establishment of Spermatogenic Stem Cell Lines from Tree Shrew. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals. Bio-101: e1010935. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010935.
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