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原代海马神经元培养与高内涵筛选模型制备

彭 彭颖*
姜 姜畅*
李 李卓轩
王 王任远
陈 陈子贤*
林 林浩东*

*Contributed equally to this work 发表时间: 2022年02月23日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010888 浏览次数: 5017

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高通量筛选实验手册
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摘要：原代海马神经元有着较高的神经元纯度、典型的神经元形态和功能，是目前对中枢神经系统病理和生理过程进行体外研究的良好选择。然而由于神经元培养条件较苛刻，目前大部分神经元培养是在培养皿或6孔板中进行，这导致无法高效率地使用神经元进行药物筛选类实验。本文在参考既往神经元培养实验的基础上结合Multidrop Combi自动分液器对原代海马神经元提取和96孔板培养方案进行了优化，并结合了雷帕霉素进行了相关药物实验，染色后使用Operetta高通量细胞成像分析系统对孔内细胞进行荧光成像并实时分析，后期结合统计软件得出药物处理效果；希望为后续此类实验提供参考。

Keywords: 原代神经元 search 高内涵 search 药物筛选 search

图1.原代海马神经元提取和高内涵药筛流程图

材料与试剂

  1. 15 mL离心管 (Corning，catalog number: 430790) 
  2. 50 mL离心管 (Corning，catalog number: 430828) 
  3. 60 mm TC处理培养皿 (Corning，catalog number: 430166) 
  4. 96孔培养板(Corning, catalog number: 3603 )
  5. 6孔培养板（Corning, catalog number: 3516）
  6. 细胞爬片（上海卧宏生物有限公司，catalog number: WHB-6-CS）
  7. 0.22 μm滤器 (Millipore，catalog number: SLGP033RB) 
  8. 20 mL注射器 (江苏华达医疗器械有限公司，catalog number: 20 mL) 
  9. P0-P1乳鼠4-6只 (C57BL/6J, 上海杰思捷实验动物有限公司) 
  10. Neurobasal培养基 (Gibco, catalog number: 21103-049)
  11. B27添加剂 (Gibco, catalog number: 17504-044) 
  12. L-谷氨酰胺 (索莱宝，catalog number: G8230) 
  13. DMEM-F12 (HyClone, catalog number: SH30023.01) 
  14. 青链霉素（Penicillin-Streptomycin (10000U/mL) ）(gibco, catalog number: 15140-122)
  15. 木瓜蛋白酶 (生工，catalog number: A501612-0100) 
  16. DNA酶（DNase I） (Acmec, catalog number: D61781)
  17. 胎牛血清（Fetal bovine serum ，FBS) (Gibco, catalog number: 10099-141) 
  18. 多聚赖氨酸溶液 (L型) (生工, catalog number: E607015-0005) 
  19. 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline, PBS）(上海元象医疗器械有限公司, catalog number: YXB5001) 
  20. 4%多聚甲醛固定液（碧云天，catalog number: P0099-100mL）
  21. BODIPY581/591 C11(Thermo Fisher，catalog number: D3861)
  22. Hoechst33342(生工，catalog number: E607302-0025)
  23. 二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）（Sigma, catalog number: D2650-100ML）
  24. 雷帕霉素（selleck，catalog number: AY-22989）
  25. QuickBlockTM免疫染色封闭液（碧云天，catalog number: P0260）
  26. Anti-MAP2 Rabbit pAb（Servicebio，catalog number: GB1128-2）
  27. Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）Fluor488-conjugated（affinity，catalog number: S0018）
  28. 抗荧光淬灭封片液（含DAPI）（碧云天，catalog number: BL539A）
  29. 10% 84消毒液
  30. 二蒸水
  31. 神经元无血清培养基 (见溶液配方)
  32. 完全培养基 (见溶液配方)
  33. 木瓜蛋白酶 (见溶液配方)
  34. DNase I (见溶液配方)
  35. BODIPY581/591储存液 (见溶液配方)
  36. BODIPY581/591+Hoechst33342混合染液 (见溶液配方)
  37. 雷帕霉素储存液 (见溶液配方)
  38. 含雷帕霉素神经元无血清培养基梯度液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher，model: 3111型) 
  2. Multidrop Combi自动分液器(Thermo Fisher，catalog number: 5840300)
  3. Operetta高通量细胞成像分析系统（Perkin Eimer）
  4. 70 μm滤网 (上海卧宏生物科技有限公司，catalog number: WHB-70 μm) 
  5. 体式显微镜 (Nikon，model: SMZ745) 
  6. 倒置生物显微镜 (Leica，model: DMi8) 
  7. 超净工作台 (苏州泰安空气技术有限公司，model: SW-CJ-2FD) 
  8. 细胞计数板 (MARIENFELD，model: AP-0650010) 
  9. 眼科显微器械 (创微美，model: 16 CM) 
  10. 制冰机 (知信仪器，model: ZX-80X)

实验步骤

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：彭颖, 姜畅, 李卓轩, 王任远, 陈子贤, 林浩东. (2022). 原代海马神经元培养与高内涵筛选模型制备. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010888. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010888.
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How to cite: Peng, Y., Jiang, C., Li, Z. X., Wang, R. Y., Chen, Z. X. and Lin, H. D. (2022). 原代海马神经元培养与高内涵筛选模型制备. // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010888. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010888.
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