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全基因组siRNA高通量筛选调控Wnt/β-catenin信号转导的关键基因

High-throughput Genome-wide siRNA Screen for Key Genes Regulating Wnt/β-CateninSignaling

毛 毛丽
宋 宋晓敏
李 李林

发表时间: 2021年12月07日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010884 浏览次数: 3196

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高通量筛选实验手册
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摘要：经典Wnt信号通路在胚胎发育以及维持成体稳态中都扮演重要角色，这条信号通路的失调和众多人类疾病密切相关。β-catenin是经典Wnt信号通路中的核心信号分子，β-catenin的累积和入核标志着Wnt信号通路的激活，这也是很多Wnt信号通路失调导致疾病发生的关键。因此，解析β-catenin异常累积的调控机制不仅可以促进人们对经典Wnt信号通路信号转导机制的认识，还可能为相关疾病的诊疗发现新的药物靶标和治疗策略。为此，我们建立了Opera高内涵高通量筛选系统，针对全基因组siRNA文库进行筛选，以获得在Wnt3a诱导条件下对β-catenin的稳定性产生显著影响的基因。随后，为了避免基因功能冗余导致假阴性表型，我们根据基因序列和蛋白质功能的相似性建立了一个针对功能基因簇的全基因组基因家族siRNA组合文库，并对组合文库进行了Opera高内涵筛选。对比基于单基因文库和基于组合文库的这两种不同筛选，我们发现基于基因家族siRNA组合文库的筛选能有效减少基因功能冗余所导致的假阴性现象，在筛选中我们也发现了一些未知的Wnt信号调控因子的线索。

实验流程概图


Keywords: Wnt信号通路 search β-catenin search 基因家族 search 功能冗余 search 高通量筛选 search

材料与试剂

  1. 细胞培养384微孔板 (Perkin Elmer, catalog number: 6007460)
  2. L细胞 (ATCC, catalog number: CRL-2648)
  3. 胎牛血清 (Invitrogen, catalog number: 10099141) 
  4. 多聚甲醛 (Alfa Aesar, catalog number: 30525894)
  5. DMEM培养液 (Invitrogen, catalog number: C11995500CP) 
  6. siRNA文库 (Dharmacon,100 nM) 
  7. Opti-MEM (Invitrogen, catalog number: 31985070) 
  8. 转染试剂RNAiMAX (Invitrogen, catalog number: 13778150) 
  9. PBST (PBS添加 0.1% triton-X100) 
  10. DAPI (Sigma, catalog number: D9542) 
  11. Ctrl siRNA (Dharmacon, catalog number: D-001220) 
  12. 针对小鼠LRP6的siRNA (Dharmacon, catalog number: M-040651)
  13. 针对小鼠APC的siRNA (Dharmacon, catalog number: M-043292) 
  14. 靶向β-catenin 的siRNA 5'-ACCAUGCAGAAUACAAAUGAU-3'(GenePharma) 
  15. β-catenin 抗体 (BD Transduction Laboratories, catalog number: 610154) 
  16. β-tubulin抗体 (Cell Signaling Technology, catalog number: 2146S) 
  17. Cy3荧光标记的二抗 (Jackson, catalog number: 115-165-062)
  18. PBST (见溶液配方)
  19. Wnt3a纯化 (见溶液配方)

仪器设备

  1. Biomek FX自动化液体处理平台体(Beckman Coulter 公司)
  2. Multidrop微孔板分液器 (Thermo Fisher公司) 
  3. ELX405微孔板洗板机 (BioTek公司) 
  4. 高内涵细胞分析仪Opera LX (PerkinElmer公司) 
  5. 细胞培养箱 (Thermo Fisher公司)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：毛丽, 宋晓敏, 李林. (2021). 全基因组siRNA高通量筛选调控Wnt/β-catenin信号转导的关键基因. // 高内涵成像及分析实验手册. Bio-101: e1010884. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010884.
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How to cite: Mao, L., Song, X. M. and Li, L. (2021). High-throughput Genome-wide siRNA Screen for Key Genes Regulating Wnt/β-CateninSignaling. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook. Bio-101: e1010884. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010884.
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