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高通量筛选乙酰转移酶活性抑制剂

High-throughput Screening of Acetyltransferase Inhibitors

杨 杨文思*
陈 陈晓慧*
张 张林*
兰 兰姝珏

*Contributed equally to this work 发表时间: 2021年11月12日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010873 浏览次数: 2835

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高通量筛选实验手册
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摘要：酶是生命活动的重要调控者，引起多种生物活性分子的修饰，通过蛋白磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰参与调控多种细胞信号转导，包括细胞增殖、凋亡和代谢等。因此，在药物开发领域，酶是重要的靶点蛋白，如激酶、吲哚胺双加氧酶、泛素化酶、乙酰转移酶、溶菌酶、肌醇酶、DNA糖基化酶等。酶活抑制剂的筛选常利用含染料的底物或能够生成荧光物质的探针，经酶催化反应后生成具有荧光的物质 (如蛋白酶介导的肽荧光基团的裂解)，或酶促反应生成的产物/副产物与对其敏感的探针发生反应，生成具有荧光的副产物，然后利用荧光检测方法获取相关信号。本文介绍了高通量筛选乙酰转移酶小分子抑制剂的实验方法。筛选分为初筛和二次筛选两部分。初筛利用生化水平酶活反应系统，针对一万多种小分子化合物展开，经重复验证，初筛阳性率约1%。进而，利用基于SPR技术的Biacore 8K仪器开展二次筛选。经过两轮筛选，最终获得约3‰能够结合酶蛋白且有效抑制酶活的苗头化合物。该筛选方法简便快捷，筛选结果稳定可靠，为靶向乙酰转移酶的药物研发提供候选分子，同时有希望应用于其它种类的酶活抑制剂的筛选工作。

Keywords: 高通量 search 化合物筛选 search 酶活抑制剂 search

图文摘要



乙酰转移酶活性抑制剂的筛选实验总流程图。使用Multidrop和Bravo等自动化仪器将化合物稀释和分装到实验用384孔板内进行生化反应，随后利用Envision仪器测定实验信号，挑选出初筛阳性化合物。进一步应用Biacore 8K仪器开展二次筛选，并测定靶蛋白与化合物的亲和力。

材料与试剂

  1. 96孔板 (Costar, 3879)
  2. 96孔板 (Greiner, 650101) 
  3. 384孔板 (PE, OptiPlate, 6007279) 
  4. TCA (Sigma, T6399-100G) 
  5. CPM (Sigma, C1484-25MG) 
  6. Tris-HCl (Sigma, 10812846001) 
  7. NaCl (Sigma, S9888-1KG) 
  8. Glycerol (国药集团化学试剂有限公司, 10010618) 
  9. TWEEN-20 (Beyotime, ST825) 
  10. Sensor Chip CM7传感器芯片 (GE Healthcare, 29147020/29-1470-20) 
  11. EDC (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50) 
  12. NHS (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50) 
  13. 乙醇胺 (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50) 
  14. 醋酸钠 (GE Healthcare, Acetate 5.5, BR-1003-52) 
  15. HBS (GE Healthcare, HBS-N buffer, 10x, BR-1006-70) 
  16. DMSO (Sigma, D2650-100 ml) 
  17. 化合物 (由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台提供)

仪器设备

  1. Multidrop自动分液器 (Thermofisher, model: Multidrop Combi) 
  2. Bravo自动化液体处理平台 (Agilent, model: Bravo) 
  3. Envision多标记微孔板检测仪 (PE, model: Envision) 
  4. 离心机 (Eppendorf, model: 5810R) 
  5. Biacore 8K (GE Healthcare, model: Biacore 8K)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：杨文思, 陈晓慧, 张林, 兰姝珏. (2021). 高通量筛选乙酰转移酶活性抑制剂. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010873. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010873.
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How to cite: Yang, W. S., Chen, X. H., Zhang, L. and Lan, S. Y. (2021). High-throughput Screening of Acetyltransferase Inhibitors. // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010873. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010873.
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