Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

报告基因系统高通量筛选酶蛋白的小分子抑制剂

High-throughput Screening Small Molecule Inhibitors of Enzyme by Reporter Gene System

陈 陈晓慧*
邹 邹怡然*
兰 兰姝珏
王 王海波

*Contributed equally to this work 发表时间: 2021年11月12日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010866 浏览次数: 2933

返回专辑目录

高通量筛选实验手册
pdf PDF PDF
ask 提问与回复
引用
收藏
被引用
摘要：报告基因实验通过将报告基因的cDNA序列融合于特定启动子调控序列或目的基因之后，稳定或瞬时转染到哺乳动物细胞中，使目标基因的表达调控成为可能。该方法的主要优点是灵敏、可靠、操作方便、动态范围广、适应于高通量筛选，在药物研发过程中广泛应用于对靶点的研究。本文介绍了利用报告基因系统高通量筛选酶活小分子抑制剂的实验方法。本文选取一种在正常组织中相对低表达或不表达，但在多种恶性肿瘤中高表达的羟化酶。已知该羟化酶能够通过调控Notch信号通路来发挥促癌功能(Platonova et al., 2017)。因此，我们通过构建Notch信号通路驱动的GFP报告基因系统，高通量筛选能够抑制羟化酶活性或调控羟化酶表达的小分子化合物。筛选过程分为单浓度单点单细胞系的大规模初筛和在三株肿瘤细胞中的IC50测定两部分。初筛将三质粒瞬时共转染HEK293T细胞，Incucyte仪器能够长时间记录加入小分子化合物后细胞中GFP荧光强度的变化，进而分析比较一万多种小分子化合物对羟化酶激活Notch信号通路的抑制作用。经重复验证，初筛阳性率约2%。进而，将初筛得到的阳性Hits在三株羟化酶高表达的肿瘤细胞以及HEK293T细胞中进行IC50测定。通过IC50值的比较，挑选出能够特异性抑制羟化酶高表达的肿瘤细胞增殖而对HEK293T细胞增殖无显著影响的化合物，为靶向羟化酶和Notch信号通路治疗肿瘤的研究提供候选小分子药物。

Keywords: 高通量 search 报告基因筛选系统 search 酶活抑制剂 search 小分子化合物 search



图1. 筛选实验总流程.

材料与试剂

  1. 96孔板 (Costar, catalog number：3879)
  2. 384孔板 (Corning, catalog number：3764)
  3. 384-Roche plate (TTP)
  4. ABgene 384-0781 (ABgene) 
  5. CountessTM 细胞计数腔室载玻片 (Thermofisher, catalog number：C10228)
  6. DMEM培养基 (HyClone)
  7. Opti-MEM (Gibco)
  8. 0.25% Trypsin (Invitrogen)
  9. FugeneHD (Promega)
  10. DMSO (sigma)
  11. CellTiter-Glo (Promega) 
  12. 化合物 (由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台提供) 
  13. DMEM完全培养基(见溶液配方)

仪器设备

  1. Multidrop自动分液器 (Thermofisher,model number：Multidrop Combi)
  2. Bravo自动化液体处理平台(Agilent,model number：Bravo)
  3. 离心机 (Eppendorf,model number：5810R)
  4. Incucyte活细胞长时间动态影像成像分析仪 (Essen BioScience, model number：Incucyte FLR)
  5. Mosquito (Labtech TTP) 
  6. 细胞计数仪(BodBoge, model number：JSY-SC-022)
  7. 多标记微孔板检测仪(PerkinElmer,model number：Envision)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：陈晓慧, 邹怡然, 兰姝珏, 王海波. (2021). 报告基因系统高通量筛选酶蛋白的小分子抑制剂. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010866. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010866.
ris ris 下载引用格式
How to cite: Chen, X. H., Zou, Y. R., Lan, S. J. and Wang, H. B. (2021). High-throughput Screening Small Molecule Inhibitors of Enzyme by Reporter Gene System . // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010866. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010866.
ris ris Download Citation in RIS Format

您对这篇实验方案有问题吗？

在此处发布您的问题，我们将邀请本文作者来回答。同时，我们会将您的问题发布到Bio-protocol Exchange，以便寻求社区成员的帮助。

post 发布问题
0 Q&A