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利用荧光素酶报告系统高通量筛选影响蛋白表达的活性小分子

High Throughput Screening for Active Small Molecules Affecting Protein Expression by Luciferase Reporter System

林 林德颖

发表时间: 2021年10月22日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010865 浏览次数: 2772

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高通量筛选实验手册
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摘要：荧光素酶 (luciferase) 报告基因系统是一种以荧光素 (luciferin) 为底物来检测荧光素酶活性的报告系统。荧光素酶可以催化底物荧光素形成氧化荧光素，在这个过程中会发出生物荧光 (Gould and Subramani, 1988)。该系统具有灵敏度高，读数结果稳定等优点。相比于荧光蛋白，其结果经多次检测仍能保持稳定，而荧光蛋白经多次激光激发后，荧光强度会减弱。本实验欲筛选能够抑制靶蛋白A表达水平的活性小分子，而靶蛋白A表达水平很低，敲入荧光蛋白EGFP后，未能检测到荧光。因而我们引入荧光素酶报告基因系统，利用CRISPR/Cas 9技术将荧光素酶编码序列插入到神经母细胞瘤细胞系 (SH-SY5Y) 靶蛋白A编码基因的3’端。构建好的敲入细胞系将表达靶蛋白A与荧光素酶的融合蛋白。敲入细胞系经过活性小分子处理后，加入含荧光素的裂解液，检测荧光值 (luminescence) 即可判断该小分子对靶蛋白A表达水平的影响。

Keywords: 荧光素酶 search 敲入细胞系 search 蛋白表达水平 search 活性小分子 search

材料与试剂

  1. 384孔板 (Corning, catalog number: 3765)
  2. 96孔板 (Corning, catalog number: 3879)
  3. 15 ml离心管 (Thermo Scientific Nunc, catalog number: 339650)
  4. 50 ml离心管 (Thermo Scientific Nunc, catalog number: 339652)
  5. 10 cm 培养皿 (Thermo Scientific Nunc, catalog number:150466)
  6. 野生型SH-SY5Y细胞系 (American Type Culture Collection, ATCC)
  7. 敲入荧光素酶编码序列的SH-SY5Y敲入细胞系 (利用CRISPR/Cas 9系统编辑野生型细胞系基因组而获得)
  8. ONE-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, catalog number: E6130)
  9. 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 25200072)
  10. FBS (Gibco, catalog number: 10099141)
  11. Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
  12. PBS (Gibco, catalog number: 10010023)
  13. DMEM (Gibco, catalog number: 11965092) (见溶液配方)

仪器设备

  1. Multidrop™ Combi 自动分液器 (Thermo Fisher)
  2. Bravo自动化液体处理平台 (Agilent)
  3. Envision多标记微孔板检测仪 (PerkinElmer)
  4. 全自动细胞计数仪 (Bodboge)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：林德颖. (2021). 利用荧光素酶报告系统高通量筛选影响蛋白表达的活性小分子. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010865. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010865.
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How to cite: Lin, D. Y. (2021). High Throughput Screening for Active Small Molecules Affecting Protein Expression by Luciferase Reporter System. // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010865. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010865.
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