研究背景

理想的转染条件需要同时达到两方面要求：一是转染阳性率高，二是转染毒性低。影响siRNA转染效果的因素，包括转染方式、细胞接种数目、转染试剂的种类及用量、转染时间及siRNA浓度等。
转染方式 siRNA转染实验共涉及三个元素：细胞、siRNA和转染试剂。根据三个元素加入顺序的不同，转染方法分为顺式转染和反式转染两类 (Persengiev et al., 2004) (表1)。在反式转染的步骤中，先将siRNA加入多孔板中，然后加入转染试剂。转染复合物形成之后，加入细胞悬液。顺式转染则相反，先在孔中加入细胞，细胞贴壁后加入siRNA和转染试剂形成的转染复合物。对于高通量实验，反式转染是首选的转染方式，因为：1) 铺细胞和转染一步完成，自动化步骤简便，可实现更高通量；2) 不需要在一块单独的板上制备siRNA-转染试剂复合物再转移至细胞板内，节约了耗材成本；3) siRNA文库可提前制备好并储存在孔板中冰箱保存，筛选实验开展前溶解后可直接使用，文库制备和筛选实验开展的时间安排相对灵活。

表1. 顺式转染与反式转染


细胞接种数目 细胞接种数目的确定需要同时考虑两方面的因素：第一，研究者所关注的生物学表型对细胞密度的要求。例如，筛选细胞增殖的调控基因时，需尽量保证整个实验过程中细胞处于增殖状态，若过早达到接触抑制会导致丢失阳性基因，因此起始的细胞接种密度不可过高；而在利用划痕实验 (wound-healing) 鉴定细胞迁移调控因子的筛选实验中 (Wang et al., 2019)，需要保证划痕时细胞密度达到90%-100%，以排除细胞增殖对细胞迁移表型的影响。第二，不同细胞密度对转染试剂的耐受程度。转染试剂往往存在一定的细胞毒性，尤其在细胞密度过低时毒性更加显著。因此，在符合生物学表型对细胞密度要求的前提下，可尽量增加细胞接种数目，以降低转染毒性。
转染试剂 转染试剂的优化主要涉及转染试剂种类和用量。不同细胞类型适用的转染试剂种类不同。我们常用的siRNA转染试剂包括DharmaFECT及Lipofectamin RNAiMAX，均属于脂质体类转染试剂。每孔转染试剂的用量需要同时考虑转染效率、转染毒性及高通量筛选的成本。提高转染试剂的用量可以部分程度上提高转染效率，但同时会增加转染毒性及筛选成本。因此，需要综合考虑转染效率和转染毒性，在保证转染效率的情况下，选用尽可能低浓度的转染试剂。转染孔的细胞密度或细胞活力保持在无转染试剂对照孔的80%以上，一般被认为是转染毒性可接受的条件。
转染时间及siRNA浓度 我们利用Dharmacon公司的全基因组siRNA文库开展RNAi筛选时，siRNA的工作浓度一般选择20 nM，转染后48-96 h开展检测。转染时长的确定要同时考虑siRNA下调靶基因mRNA水平到靶基因蛋白水平实现下调的时间，以及所检测表型对时长的要求。若筛选体系有已知的阳性基因，可根据阳性基因siRNA出现表型的时长确定筛选体系的时长。
反式转染是高通量siRNA筛选的主要转染方式，下文重点介绍反式转染的条件优化方法。若反式转染效率不高的细胞，可开展顺式转染条件的优化，需要优化的因素及孔位排布设计与反式转染类似。
优化转染条件我们一般使用转染指示剂TOX，该siRNA进入绝大多数种类的细胞后会导致细胞死亡。若所用细胞对TOX不敏感，可选用带荧光的siRNA，通过观察进入细胞内的siRNA的荧光强度来判断转染效率。下文以TOX作为转染指示剂为例介绍反式转染优化方法。

材料与试剂

1. 96孔U底板 (Costar, catalog number: 3879)
2. 384孔黑边底透平底板 (Corning, catalog number: 3764)
3. Hela细胞 (中国科学院细胞库/干细胞库，catalog number: TCHu187)
4. ON-Target Plus^TM Non-targeting control pool (Dharmacon, catalog number: D-001810-10-05)
5. TOX transfection control (Dharmacon, catalog number: D-001500-01-05)
6. 5x siRNA buffer (Dharmacon, catalog number: B-002000-UB-100)
7. Lipofectamin RNAiMax (ThermoFisher Scientific, catalog number: 13778150)
8. DharmaFECT 1 Transfection Reagent (Dharmacon, catalog number: T-2001-04)
9. OptiMEM (Invitrogen, catalog number: 31985070)
10. DPBS (Gibco, catalog number: 2122736)
11. DMEM高糖培养基 (Hyclone, catalog number: SH30243.01)
12. Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 2120539)
13. Propidium Iodide (Invitrogen, catalog number: P3566)
14. Hoechst 33342 (Invitrogen, catalog number: H3570)
15. CellTiter Glo Viability Assay (Promega, catalog number: G7573)
    

仪器设备

1. CO₂细胞培养箱 (Thermo Fisher, model: SERIES 8000 DH)
2. 自动分液器 (Thermo Fisher, model: Multidrop Combi)
3. 多模式微孔板检测仪 (PerkinElmer, model: Ensight)
4. 多功能酶标仪 (PerkinElmer, model: Envision)
5. 低温水平离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5810R)
6. 细胞计数仪 (BodBoge, model: JYS-SC-021H)
   

实验步骤