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调控RANKL降解的E3泛素连接酶的筛选

Screening of E3 Ubiquitin Ligase that Regulates RANKL Degradation

王 王婧惠
索 索金龙
邹 邹卫国

发表时间: 2021年10月22日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010860 浏览次数: 2185

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摘要：RANKL是成骨细胞与破骨细胞交流的关键因子，是治疗骨质疏松的重要靶点 (Koldkjaer Solling et al., 2016; Han et al., 2018)。我们前期工作发现RANKL通过蛋白酶体途径泛素化降解。泛素化涉及三个主要步骤：活化，结合和连接，分别由泛素激活酶 (E1)，泛素结合酶 (E2s) 和泛素连接酶 (E3s) 执行，其中E3连接酶具有底物特异性 (Dikic et al., 2009)。为了找到RANKL泛素化降解相关的关键调控E3连接酶，我们利用化学生物学技术平台的Mouse siGenome全基因组siRNA文库中部分与泛素化E3连接酶相关的文库进行筛选。在成骨细胞系C3H10中构建稳定表达RANKL-GFP 融合蛋白的单克隆细胞株，在该细胞株中转染E3 ligase siRNA文库，通过GFP蛋白的荧光强度变化反映RANKL的表达水平，从而找到能够特异性调控RANKL降解的E3连接酶。

Keywords: RANKL search 泛素化降解 search E3连接酶 search siRNA文库筛选 search



图1. 筛选流程示意图

材料与试剂

  1. 384孔板 (PerkinElmer, ViewPlate-384 F TC, catalog number: 6007460)
  2. Mouse siGenome全基因组siRNA文库之Ubiquitin Conjugation Subset化学生物学技术平台的整库筛选类siRNA文库购自Dharmacon品牌，以SMARTpool的形式保存于384孔板中，每条基因的对应孔位中同时含有4条不同序列的siRNAs (SMARTpool试剂)，从而保证产生高效的基因沉默效果。我们使用其中与泛素化相关的亚文库：
    Ubiquitin Conjugation Subset 1：包含针对小鼠Cullin、E1、E2、HECT E3 Ligases等79个基因的siRNA亚文库。
    Ubiquitin Conjugation Subset 2：包含针对小鼠F-box和SOCS box E3 Ligases等102个基因的siRNA亚文库。
    Ubiquitin Conjugation Subset 3：包含针对小鼠RING finger和RING finger-like E3 Ligases等330个基因的siRNA亚文库。
  3. Opti-MEM (Gibco, catalog number: 31985070)
  4. MEM Alpha Medium (Corning, catalog number: 10-022-CV)
  5. DPBS (Corning, catalog number: 21-031-CVR)
  6. Fetal Bovine Serum (Ausbian, catalog number: VS500T)
  7. penicillin streptomycin (Gibco, catalog number: 15140-122)
  8. 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 25200-072)
  9. GFP tag Mouse McAb (proteintech, catalog number: 66002-I-Ig)
  10. Rabbit Anti-Mouse HRP (Dako Denmark A/S, catalog number: P0260)
  11. Nonspecific Ctr Pool (Thermo Fisher, catalog number: D-001206-13-05)
  12. RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo Fisher, catalog number: 13778150)
  13. DharmaFECT 1 Transfection Reagent (Thermo Fisher, catalog number: T-2001-02)
  14. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: D2650)
  15. MG132 (Selleck, catalog number: S2619)
  16. Hoechst 33342 (Invitrogen, catalog number: H21492)
  17. 16% PFA (Alfa Aesar, catalog number: 30525-89-4)

仪器设备

  1. 干细胞多色流式细胞分选仪Aria III (BD, BD FACS Aria III)
  2. 干细胞多色流式检测仪cytoflex LX (Beckman, CytoFlex LX五激光)
  3. 全光谱激发共聚焦显微镜 Leica SP8 WLL (Leica, Leica TCS SP8 WLL)
  4. Ensight多功能微孔板检测仪 (PerkinElmer, Ensight)
  5. Multidrop自动分液器 (Thermo Fisher, Multidrop Combi)
  6. Elx405自动洗板机 (BioTek, ELx405)
  7. 台式高速大容量冷冻离心机 (Eppendorf, 5810R)
  8. CO2细胞培养箱 (Thermo Fisher, Series 8000 Direct-Heat CO2 Incubator, 184 L)
  9. Opera激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统 (PerkinElmer, Opera LX488/561/640)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：王婧惠, 索金龙, 邹卫国. (2021). 调控RANKL降解的E3泛素连接酶的筛选. // 高内涵成像及分析实验手册. Bio-101: e1010860. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010860.
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How to cite: Wang, J. H., Suo, J. L. and Zou, W. G. (2021). Screening of E3 Ubiquitin Ligase that Regulates RANKL Degradation. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook. Bio-101: e1010860. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010860.
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