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hcGAS特异性小分子抑制剂体外高通量筛选

High-throughput Screening of Human cGAS Specific Small Molecule Inhibitors in Vitro

侯 侯燕飞*
杨 杨银龙*
张 张从刚

*Contributed equally to this work 发表时间: 2021年10月22日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010857 浏览次数: 1923

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高通量筛选实验手册
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摘要：固有免疫是机体面对病原入侵时启动的第一道屏障，其中的cGAS-STING信号通路是主要的DNA固有免疫通路 (Wu et al., 2012)。核心蛋白环鸟苷酸-腺苷酸合成酶 (cyclic GMP-AMP synthase, cGAS) 是一种胞质DNA感受器，能够识别并结合存在于细胞质中的双链DNA，催化ATP与GTP合成第二信使2’,3’-cGAMP (Gao et al., 2013; Sun et al., 2013)，激活下游干扰素刺激因子 (Stimulator of interferon gene, STING)，STING招募TBK1以激活干扰素调节因子IRF3和NF-κB，并诱导I型干扰素和其它免疫应答基因的表达，进而激活机体固有免疫反应 (Civril et al., 2013; Du et al., 2018)。cGAS的异常激活被认为与各种自身免疫性疾病有关，因此，高活性与特异性的cGAS小分子抑制剂具有成为自身免疫性疾病治疗药物的潜质 (Lama et al., 2019)。另一方面，体外高通量筛选的方法，是小分子抑制剂开发中获得先导化合物的经典手段。本文详细描述了对cGAS抑制剂进行体外高通量筛选的方法，该方法基于体外生化实验检测cGAS底物ATP的消耗量，并以此评估cGAS的酶活性的变化，从而进行cGAS小分子抑制剂的筛选。该方法得到的新型cGAS抑制剂先导化合物，将有望作为cGAS依赖性天然免疫途径的小分子化学探针，为相关自身免疫性疾病的研究与治疗提供基础。

Keywords: 固有免疫 search cGAS search 小分子抑制剂 search 体外高通量筛选 search

材料与试剂

  1. 384孔细胞培养板 (NEST，catalog number: 761601)
  2. ATP (Sigma，catalog number: A6559-25UMO)
  3. GTP (Sigma，catalog number: G8877-25MG)
  4. HT-DNA (Sigma，catalog number: D6898)
  5. NaCl (Solarbio，catalog number: S8210)
  6. MgCl2 (Solarbio，catalog number: M8161)
  7. ZnCl2 (麦克林，catalog number: Z820759)
  8. DTT (碧云天，catalog number: ST043-5g)
  9. PMSF (solarbio, catalog number: P8340-5g)
  10. Tween-20 (碧云天，catalog number: ST825-500ml)
  11. Tris (Solarbio, catalog number: T8060)
  12. Hepes (Solarbio, catalog number: H8090-500g)
  13. D-luciferin potassium salt (碧云天, catalog number: ST196-25mg)
  14. 蛋白纯化重悬缓冲液 (见溶液配方)
  15. 蛋白纯化wash缓冲液 (见溶液配方)
  16. 阴离子交换柱层析缓冲液 (见溶液配方)
  17. 凝胶过滤层析缓冲液 (见溶液配方)
  18. cGAS反应缓冲液 (见溶液配方)
  19. ATP-LUM检测缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. ÄKTA蛋白纯化系统 (GE Healthcare, model: ÄKTA pure25)
  2. 镍离子亲和柱 (GE Healthcare, model: Chelating SepharoseTM Fast Flow)
  3. 阴离子交换柱 (GE Healthcare, model: MONO Q 5/50 GL)
  4. 凝胶过滤层析柱 (GE Healthcare, model: Superdex 200 Increase 10/300GL)
  5. 肝素柱 (GE Healthcare, model: HiTrap Heparin HP 5×5ML)
  6. 微量离心机 (Thermo scientific, model: LEGEND Micro 21R)
  7. 高速落地离心机 (Thermo scientific, model: LYNX4000)
  8. 摇床 (上海旻泉, model: MQD-S2R)
  9. 高压灭菌锅 (STIK, model: IMJ-78A)
  10. 超声波细胞破碎仪 (宁波新芝, model: SCIENTZ-IID)
  11. 移液器 (吉尔森, model: P2/20/200/1000N)
  12. 多通道移液器 (Eppendorf, model: P100N)
  13. PCR扩增仪 (杭州博日, model: YC-XP-D)
  14. 酶标仪 (BioTek, model: cytation3)
  15. 声波移液系统 (贝克曼库尔特, model: Echo550)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：侯燕飞, 杨银龙, 张从刚. (2021). hcGAS特异性小分子抑制剂体外高通量筛选. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010857. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010857.
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How to cite: Hou, Y.F., Yang, Y.L. and Zhang, C.G. (2021). High-throughput Screening of Human cGAS Specific Small Molecule Inhibitors in Vitro. // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010857. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010857.
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