摘要:DNA甲基化异常常见于多种癌症和神经系统疾病,并在其中发挥着重要的调控作用。开发新型DNA甲基化抑制剂得到的先导化合物需要在细胞中进一步验证和定量评估其在体内的潜在去甲基化活性。我们实验室此前建立了DNA甲基化报告细胞系B2-17,即在HEK293细胞基因组中插入了被DNA甲基化沉默的CMV启动子以及由其驱动的EGFP绿色荧光报告基因。启动子DNA甲基化是表观遗传学中导致基因沉默的一种经典调控机制,DNA甲基化修饰可通过甲基化结合蛋白招募组蛋白去乙酰化酶,组蛋白去乙酰化会改变组蛋白所带的电荷特性以及染色质的开放程度,最终导致基因沉默。使用DNA甲基化抑制剂处理报告细胞可以诱导CMV启动子发生被动去甲基化,从而激活EGFP报告基因的表达。使用Opera高内涵成像系统可以定量评估DNA甲基化抑制剂在细胞中的去甲基化活性,从而指导对抑制剂的后续改造和优化。
材料与试剂
- 100 mm Cell Culture Dish with Clear Lid, Sterile (NEST, catalog number: 704001)
- CellCarrier-96 Black, Optically Clear Bottom, Tissue Culture Treated (PerkinElmer, catalog number: 6005550)
- Poly-D-Lysine (PDL) (Beyotime, catalog number: C0312)
- Hoechst 33342 (Beyotime, catalog number: C1022, stored at -80 °C)
- DMEM medium (Hyclone, catalog number: SH30243.01, stored at 4 °C)
- Fetal Bovine Serum (Biological Industries, catalog number: 04-001-1ACS, stored at -80 °C)
- Penicillin-streptomycin (ThermoFisher, catalog number: 15140148, stored at 4 °C)
- Decitabine (Selleck, catalog number: S1200, aliquoted and stored at -80 °C)
- DMSO (MP Biomedicals, catalog number: 196055)
- 1x DPBS (ThermoFisher, catalog number: 14190144)
- Trypsin-Versene mixture (Lonza, catalog number: 17-161E, stored at 4 °C)
- Trypan Blue 0.04% solution (Gibco, catalog number: 15250061)
- DMEM培养基 (见溶液配方)
- PDL溶液 (见溶液配方)
- Hoechst 33342工作溶液 (见溶液配方)
仪器设备
- 二氧化碳细胞培养箱 (Memmert, CO2 incubator ICO50)
- 无菌超净工作台 (ESCO, model: AC2-4S1)
- 水平转子低速离心机 (ThermoFisher, model: Labofuge 400)
- 八连排移液枪 (ThermoFisher, model: 14-386-352N))
- Bright Line Hemocytometer (Weber Scientific, model: 3048-11)
- Opera Phenix High-Content Screening System (PerkinElmer, model: HH14000000)
实验步骤
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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