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结直肠癌类器官高通量药物筛选方法

High-throughput Drug Screening in Colorectal Cancer Organoids

杜 杜辉*
陈 陈世阳*
陈 陈剑峰

*Contributed equally to this work 发表时间: 2021年08月06日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010843 浏览次数: 3863

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高通量筛选实验手册
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摘要：类器官(organoid)是由不同类型和功能的细胞组成的类似于体内器官的3D培养细胞结构。与传统的2D培养的细胞系相比，类器官能够更真实地模拟体内细胞的生存空间与生长状况，因而在疾病研究和药物筛选等方面有着重要的前景(van de Wetering et al., 2015)。肿瘤类器官(patient derived organoid, PDO) 作为研究肿瘤的新型工具，在保留肿瘤原有的生物学特征之外，还能够稳定的传代，因此在肿瘤药物的开发与筛选上有着得天独厚的优势(Roerink et al., 2018)。Vlachogiannis等 (Vlachogiannis et al., 2018) 证明了患者来源的类器官能够模拟患者对药物的反映，可以被用于个体化药物治疗。Verissimo等(Verissimo et al., 2016) 在体外利用原代肿瘤类器官库的基因多样性明确了RAS基因突变在结直肠癌中的耐药性机制。本实验方案中，我们利用CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay来对细胞数目进行测定，其原理是通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目，目前该方法已被国内外广泛应用。该实验方案可以同时检测多株PDO对于多种药物的敏感性，而且在384孔板中进行药物筛选可以极大程度节省实验成本。本文主要介绍了结直肠癌类器官的高通量药物筛选系统，为药物研发以及临床个性化治疗提供新的思路和指导。

Keywords: 类器官 search 高通量 search 药物筛选 search

图文摘要



类器官高通量药物筛选流程图

材料与试剂

  1. 15 ml离心管 (Gene Brick, catalog number: GP04-6500)
  2. 50 ml离心管 (Gene Brick, catalog number: GP04-7500)
  3. CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay (Promega, catalog number: G9683)
  4. 384孔板 (Corning, catalog number: 3765)
  5. Matrigel胶 (Corning-Biocoat, catalog number: 356231)
  6. Advanced DMEM/F12 (Life Technologies, catalog number: 12634028)
  7. HEPES (Sigma)
  8. GlutaMax (Gibco, catalog number: 35050061)
  9. Penicillin-Streptomycin (Gibco, catalog number: 15140163)
  10. B27 supplement (Gibco, catalog number: 17504044)
  11. N-Acetyl-L-cysteine (Sigma, catalog number: A9165)
  12. (Leu15) Gastrin-1, human (Anaspec, catalog number: AS-64149)
  13. Human EGF (Pepro Tech, catalog number: AF-100-15-500)
  14. Human Noggin (Novoprotein, catalog number: CB89)
  15. 10% R-Spondin1 conditional medium
  16. A83-01 (Tocris, catalog number: 2939)
  17. Nicotinamide (MCE, catalog number: HY-B0150)
  18. Prostaglandin E2 (MCE, catalog number: HY-101952)
  19. Primocin (InvivoGen, catalog number: ant-pm-1)
  20. TrypLETM Express (Thermofisher-Invitrogen, catalog number: 12604013)
  21. CountessTM细胞计数腔室载玻片 (Thermofisher, catalog number: C10228)
  22. T8+ Dispensehead Cassettes (Tecan, catalog number: 30097370)
  23. 84消毒液 (江苏爱特福, catalog number: LB1250)
  24. PDO培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 4 °C离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
  2. Multidrop自动分液器 (Thermofisher, model: Multidrop Combi)
  3. Envision多标记微孔板检测仪 (PE, model: Envision)
  4. 非接触式数码滴定仪 (Tecan, model: D300e)
  5. Countess II FL全自动细胞计数仪 (Thermofisher, catalog number: AMQAX1000)
  6. 37 °C水浴锅 (上海精宏, catalog number: DK-420)
  7. 细胞培养箱 (Thermofisher, model: 3111)
  8. TS-8转移摇床调速 (其林贝尔, model: TS-8)
  9. 荧光显微镜 (Olympus)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：杜辉, 陈世阳, 陈剑峰. (2021). 结直肠癌类器官高通量药物筛选方法. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010843. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010843.
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How to cite: Du, H., Chen, S. Y., Chen, J. F. (2021). High-throughput Drug Screening in Colorectal Cancer Organoids. // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010843. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010843.
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