研究背景

水体重金属污染是目前日益严重的环境问题之一，铜作为一种典型的重金属污染物，对水生生物构成严重威胁，其可以直接扰乱蛋白质结构，抑制过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GPx等抗氧化酶的活性，导致活性氧的形成 (Gaetke and Chow, 2003)。过量的活性氧会对生物体产生氧化损伤，导致细胞死亡，因此准确测定生物体内的活性氧的含量和分布十分重要。荧光标记由于具有灵敏度高，活性高，显微成像分辨率高，实时检测等优点，成为一个检测活性氧的有发展前景的有利工具。本研究方法中使用DCFH-DA和CellROX Orange Reagent两种荧光探针，这两种探针本身没有荧光，可自由穿过细胞膜，一旦与细胞内的活性氧反应便分别会产生明亮的绿色荧光和橙黄色荧光，且荧光物质不能穿过细胞膜，因此，荧光强度与细胞内的活性氧成正比。但是大型溞自身会产生绿色的自发荧光，为了将荧光探针与活性氧反应产生的荧光与自发荧光区分开来，本研究采用两种探针标记以便更好地验证大型溞体内活性氧产生的含量 (Fan et al., 2020)。
本方法选用大型溞为研究对象，一种理想的毒性试验模型生物，用两种荧光探针标记铜暴露后大型溞体内的活性氧，最后借助高内涵成像系统进行分析。高内涵成像分析系统因具有转盘式共聚焦快速扫描，灵活的激发发射波长搭配，超大的成像视野，超强的图像分辨率以及强大的图像分析功能，可以很好地帮助我们分析了铜诱导的大型溞体内活性氧的含量及分布。

材料与试剂

1. Corning^® 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates (Individually Wrapped, with Lid, Sterile, 3603, Corning)
2. Cypress^® 15 ml离心管 (BaiCheng Technology Co., Ltd)
3. 一次性使用培养皿70 mm (江苏天力医疗器械有限公司)
4. Cu(NO₃)₂, (100 µg/ml, National Institute of Metrology)
5. CaCl₂·2H₂O (10035-04-8, Sigma)
6. MgSO₄·2H₂O (10034-99-8, Sigma)
7. NaNO₃ (7631-99-4, Aladdin)
8. NaHCO₃ (144-55-8, Sigma)
9. Na₂SiO₃·9H₂O (13517-24-3, 西陇化工有限公司)
10. NaCl (7647-14-5, 西陇科学股份有限公司)
11. H₃BO₃ (10043-35-3, Sigma)
12. KCl ((GB/T 646-1993) 9320，北京化工厂)
13. KH₂PO₄ (7778-77-0, Sigma)
14. K₂HPO₄ (7758-11-4, Sigma)
15. NaH₂PO₄·2H₂O (13472-35-0，西陇科学股份有限公司)
16. Na₂HPO₄ (7558-79-4，国药集团化学试剂有限公司)
17. 50%戊二醛 (111-30-8, Aladdin)
18. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) (4091-99-0, 上海懋康科技有限公司)
19. CellROX Orange Reagent (50103ES50, 上海翊圣生物科技有限公司)
20. 二甲基亚砜 (DMSO) (67-68-5, Aladdin)
21. 人工配水 (见溶液配方)
22. Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液 (见溶液配方)
23. DCFH-DA孵育溶液 (见溶液配方)
24. CellROX Orange Reagent孵育溶液 (见溶液配方)
25. 麻醉溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 恒温恒湿培养箱 (GXZ, 宁波江南仪器厂)
2. 高内涵成像分析系统 (PerkinElmer, USA)

实验步骤