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利用高内涵筛选系统进行线粒体膜电位检测 (TMRM染色)

Mitochondrial Transmembrane Potential (ΔΨm) Detection Using High Content Screening System

麻 麻宁宁
陈 陈静
任 任进

发表时间: 2021年07月07日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010834 浏览次数: 4113

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高内涵成像及分析实验手册
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摘要：线粒体膜电位的高低可以反应线粒体功能的完整性，是反应线粒体功能状态的重要指标之一。四甲基罗丹明甲酯 (tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM) 是一种细胞渗透性阳离子亲脂性红色荧光染料，其进入细胞后，被细胞内酯酶切离，产生四甲基罗丹明。四甲基罗丹明进入线粒体后，被线粒体俘获，分布和结合在线粒体内膜上，呈现强烈荧光。线粒体膜电位的高低变化决定了TMRM的分布浓度。电位高，TMRM在线粒体的浓度高，显示为强力红色或桔红色；反之，TMRM弥散在胞浆内，荧光减弱表明线粒体膜电位受到损害。(Creed and McKenzie, 2019)。 棕榈酸 (palmitate，PA) 作为一种动植体内常见的高级饱和脂肪酸，已被发现可以通过其脂毒性诱导细胞凋亡。PA造成的脂毒性会引起细胞线粒体膜的去极化，膜电位降低 (Jun et al., 2011)。本实验在细胞内转染miRNA mimics后，加入可导致细胞线粒体膜电位损伤的PA，然后利用TMRM染色检测红色荧光强度以指征线粒体膜电位的高低，使用Operetta CLSTM (PerkinElmer，USA) 对细胞中的荧光进行信号采集和定量，通过基于图像的高内涵筛选 (high content screening, HCS) 分析从而筛选可以缓解或加重PA导致的线粒体膜电位损伤的miRNAs (Massey, 2015)。

Keywords: 线粒体膜电位 search TMRM search 棕榈酸 (PA) search Operetta CLSTM search

材料与试剂

  1. 96 Well Black Assay Plate, Clear Bottom with Lid, 3603 (Corning Costar, Cambridge, MA, catalog number: 04119005)
  2. HepG2细胞 (ATCC, USA)
  3. Opti-MEM (Gibco，catalog number: 11058021)
  4. Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, catalog number: 13778075)
  5. miRNA mimics (上海吉玛制药技术有限公司)
  6. MEM/EBSS培养基 (Hyclone, Logan, UT, USA，catalog number: AF29549370)
  7. Penicillin/Streptomycin (Gibco, Germany，catalog number: 15240-062)
  8. 四甲基罗丹明甲酯TMRM (Sigma, catalog number: T5428)
  9. CCCP (Sigma, catalog number: C2759)
  10. Hoechst 33342 (上海翌圣生物科技有限公司，Yeason，catalog number: 40731ES10)
  11. 20x PBS (上海生工生物工程有限公司，catalog number: B548117)
  12. DMSO (Sigma, catalog number: BCBZ1685)
  13. 棕榈酸钠Sodium palmitate (Sigma, catalog number: P9767)
  14. BSA，Fatty Acid Free牛血清白蛋白 (上海翌圣生物科技有限公司，Yeason，catalog number: 9048-46-8)
  15. 200 μM TMRM (见溶液配方)
  16. 1 mM CCCP (见溶液配方)
  17. 10 mg/ml Hoechst 33342储存液 (见溶液配方)
  18. MEM/EBSS完全培养基 (见溶液配方)
  19. 1x PBS (见溶液配方)
  20. 10 mM PA (见溶液配方)
  21. 9% BSA (见溶液配方)

仪器设备

  1. PerkinElmer Operetta CLSTM (PerkinElmer, USA)
  2. 移液器 (Eppendorf)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：麻宁宁, 陈静, 任进. (2021). 利用高内涵筛选系统进行线粒体膜电位检测 (TMRM染色). // 高内涵成像及分析实验手册. Bio-101: e1010834. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010834.
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How to cite: Ma, N. N., Chen, J. and Ren, J. (2021). Mitochondrial Transmembrane Potential (ΔΨm) Detection Using High Content Screening System. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook. Bio-101: e1010834. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010834.
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