研究背景

由NEAT1组装形成的paraspeckle富含复杂的蛋白质和RNA成分，因此NEAT1表达水平对于这些内含物的储存和转运影响了多种细胞生物学过程。如NEAT1协调增强由pre-RNAs内含子产生的pri-miRNA的加工(Jiang et al., 2017)；调控一类3’-UTR含有反向重复序列RNA的出核过程 (Chen and Carmichael, 2009)；NEAT1表达水平与paraspeckles的动态变化影响细胞分化、疾病进展和部分应激反应高度相关(Hirose et al., 2014; Imamura et al., 2014; Adriaens et al., 2016;Wang et al., 2018)。尽管NEAT1/paraspeckle的重要功能被陆续报道，然而NEAT1自身是如何被调控的相关研究仍相对滞后。
对于基因转录调控的筛选目前普遍使用全基因组RNAi文库或CRISPR/Cas9文库。传统的外源性的小干扰RNA (small interference RNAs, siRNAs) 对于敲减目的基因的表达是非常有效的，全基因组siRNA文库可允许研究人员通过高通量的方式研究每个基因对特定细胞表型的影响。相比之下CRISPR/Cas9筛选过程中细胞单一性较强，文库自身的可操作性更高，使用过程也更为便捷。对于NEAT1转录调控的筛选，我们在NEAT1内源启动子后插入EGFP基因，构建了用荧光强度指示NEAT1表达水平的可视化系统。由于NEAT1自身的表达水平具有一定的周期性 (Torres et al., 2016)，因此对NEAT1表达水平的监控和评估采以细胞群体为基础更为合理。所以这里我们采用RNAi文库筛选的方式对NEAT1进行转录调控的筛选。在筛选过程中，部分蛋白的敲降可能会影响细胞整体转录水平的改变或产生细胞毒性，为了避免这些蛋白产生的非特异性结果，我们利用慢病毒感染的方式在待筛选细胞中整合了由外源启动子EF1α驱动表达的mCherry作为荧光筛选的内参。最终NEAT1表达水平的改变由EGFP，mCherry以及EGFP/mCherry三个参数进行确定。

材料与试剂

1. HeLa细胞 (ATCC, catalog number: CCL-2)
2. HEK293细胞 (ATCC, catalog number: CRL-1573)
3. DMEM (Gibco^TM, catalog number: 11965092)
4. Fetal bovine serum (FBS) (Gibco^TM, catalog number: 10270-106)
5. 0.25% Trypsin (Gibco^TM, catalog number: 27250018)
6. Penicillin streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
7. Opti-MEM^® I Reduced Serum Medium (Gibco^TM, catalog number: 31985070)
8. Lipofectamine^TM 3000 Reagent (Thermo, catalog number: 21341)
9. Lipofectamine^TM RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo, catalog number: 13778030)
10. Human ON-TARGETplus siRNA library –Genome- SMARTpool (Dharmacon)
11. MISSION^® esiRNA (Sigma, catalog number: EHUEGFP)
12. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN) (Addgene, catalog number: #1000000034)
13. psPAX2 (Addgene, catalog number: #12260)
14. pMD2.G (Addgene, catalog number: #12259)
15. 84消毒液
16. Phosphate buffered saline (PBS) 缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 高内涵细胞成像分析仪Operetta (PerkinElmer，Operetta高内涵细胞分析系统)
2. 自动化洗板机ELx405 (BioTek，ELx405 Select Deep Well Microplate Washer)
3. 自动化分液仪 Multidrop Combi (Thermo Fisher，Multidrop Combi自动化分液仪)
4. CO₂培养箱 (Thermo Fisher，Heracell 150i)
5. 水平离心机 (Beckman Coulter, model: Allegra X-12R)
   

实验步骤