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基于高内涵成像技术的细胞内PAR检测方法

Investigation of Cellular PAR Using High-Content Imaging System

李 李杰
孔 孔娟
杨 杨光
许 许红涛
马 马培翔

发表时间: 2021年06月24日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010829 浏览次数: 2045

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高内涵成像及分析实验手册
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摘要：DNA编码化合物库 (DEL) 是一种含有百万甚至上亿个含有特异性DNA标签的 巨型化合物库，利用靶标蛋白与DNA编码的小分子之间的亲和力进行筛选，最后通过PCR扩增和深度测序技术实现筛选信息的高通量解码 (Brenner and Lerner, 1992; Ma et al., 2019)。我们利用光交联技术和点击化学，成功构建了首个基于天然产物的DNA 编码化合物库 (nDEL)。针对靶标蛋白PARP1 (聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1) 我们筛选 得到了一个小分子抑制剂-木犀草素 (Luteolin)。细胞中的DNA一旦发生单链断裂损 伤，PARP1蛋白DNA结合结构域可以迅速地结合到损伤位点，C端的催化结构域催化NAD+分解为ADP核糖和烟酰胺，然后以ADP核糖为底物，在自身及其他蛋白的谷氨酸、天冬氨酸等残基上进行聚腺苷二磷酸核糖 (Poly [ADP-ribose], PAR) 长链修 饰，招募其他蛋白参与到DNA损伤修复等重要功能中。为了进一步探究木犀草素对于细胞内PARP1的活性抑制能力，我们使用高内涵成像技术的方法检测木犀草素处理后细胞内聚腺苷二磷酸核糖PAR生成的情况 (Yuan et al., 2017; Li et al., 2020)。

Keywords: PARP1 search PAR search 高内涵成像 search PARP1抑制剂 search DNA损伤 search

材料与试剂

  1. 96孔培养板 (Greiner Bio-One, catalog number: 655090)
  2. Fetal Bovine Serum胎牛血清 (Gibco, catalog number: 10100147)
  3. 一抗pADPr (10H) (Santa Cruz, catalog number: sc-56198)
  4. 二抗Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 (Invitrogene, catalog number: A32723)
  5. DAPI (碧云天, catalog number: C1002)
  6. DMEM培养基 (Gibco, catalog number: 11995065)
  7. PBS (上海源培生物科技有限公司, catalog number: B310KJ)
  8. 木犀草素 (美仑生物, catalog number: MB2172)
  9. olaparib (美仑生物, catalog number: MB1700)

仪器设备

  1. 哺乳动物细胞二氧化碳恒温培养箱 (Thermo Fisher Scientific, HERACELL 150i)
  2. ELISA平板洗板机 (Biotek)
  3. 高内涵成像系统 (Perkin Elmer)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：李杰, 孔娟, 杨光, 许红涛, 马培翔. (2021). 基于高内涵成像技术的细胞内PAR检测方法. // 高内涵成像及分析实验手册. Bio-101: e1010829. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010829.
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How to cite: Li, J., Kong, J., Yang, G., Xu, H. T. and Ma, P. X. (2021). Investigation of Cellular PAR Using High-Content Imaging System. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook. Bio-101: e1010829. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010829.
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