研究背景

荧光偏振 (fluorescence polarization, FP) 技术被广泛应用于药物筛选、蛋白质活性鉴定、药物分析与疾病诊断，具有均相反应、操作简便、检测灵敏、成本低廉等优点。本文以β-catenin/LEF1相互作用为靶标，将FITC-LEF1作为核转录因子LEF1的模拟物，基于偏振荧光强弱与荧光分子大小正相关的原理建立了荧光偏振高通量筛选模型 (Lea and Simeonov, 2011)。如果小分子化合物为非活性化合物，那么分子量较大的β-catenin将与分子量较小的FITC-LEF1发生特异性结合反应，荧光复合物的分子量将增大，旋转速度较慢，荧光偏振实验中表现较高的毫偏值 (millipolarization units, mP)；反之，活性化合物能够特异性阻断β-catenin与FITC-LEF1的相互作用，荧光复合物的分子量将明显减小，旋转速度较快，荧光偏振实验中则表现较低的mP值 (图1)。


图1. 荧光偏振高通量筛选方法原理示意图

材料与试剂

1. 384孔板 (PerkinElemer, catalog number: 6007270)
2. 荧光探针FITC-LEF1 (FITC-GDPELCATDEMIPFKDE-OH，纯度大于97.0%，由上海强耀生物科技有限公司合成)
3. LEF1多肽 (GDPELCATDEMIPFKDE-OH，纯度大于97.0%，由上海强耀生物科技有限公司合成)
4. Tris (Sigma, catalog number: V900483)
5. NaCl (Sigma, catalog number: V900058)
6. EDTA (Sigma, catalog number: V900106)
7. DMSO (Sigma, catalog number: V900090)
8. HCl (国药试剂，catalog number: 10011018)
9. 血根碱 (TargetMol公司，catalog number: 2781)
10. 白屈菜红碱 (TargetMol公司，catalog number: 3419)
11. H₂O
12. 天然产物化合物库 (TargetMol公司)
13. 荧光偏振反应液 (见溶液配方)
14. 重组人β-catenin (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 多功能酶标仪 (BioTek, Cytation^TM 5型)
2. 移液器 (Eppendorf)
3. 微孔板快速振荡器 (Kylin-Bell Lab, QB-9001型)
   

实验步骤