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胃癌细胞中Hippo通路负调控因子筛选-YAP出入核检测

Screening of Negative Regulators of Hippo Pathway in Gastric Cancer Cells with Nuclear Translocation of YAP as Readout

汤 汤扬
焦 焦石
周 周兆才

发表时间: 2021年06月01日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010822 浏览次数: 3229

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高通量筛选实验手册
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摘要：Hippo信号通路广泛参与器官大小调控、组织稳态、癌症发生发展等过程，该通路失活时，关键组分YAP去磷酸化，进入细胞核并调节下游靶基因的转录，促进细胞生长和癌症的发生。为了找到Hippo信号通路负调控因子，我们选取Human ON-TARGETplus (OTP) 全基因组siRNA文库进行筛选，以YAP入核抑制率作为筛选指标。首先在胃癌细胞系HGC-27中转染不同的siRNAs，运用免疫荧光呈像技术检测YAP的亚细胞定位，最后通过计算机程序对荧光图像进行统计分析，定量YAP出入核的变化，获得Hippo信号通路负调控因子。

Keywords: Hippo信号通路 search YAP入核抑制率 search 负调控因子 search siRNA高通量筛选 search 胃癌 search

材料与试剂

  1. 15 ml离心管 (Corning, catalog number: CLS430791)
  2. 50 ml离心管 (Corning, catalog number: CLS430828)
  3. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
  4. 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
  5. 96孔圆底板 (Corning, catalog number: CLS3879)
  6. 384孔Viewplate黑色透明底板 (Perkin Elmer, catalog number: 6007460)
  7. RPMI 1640 (Thermo, catalog number: 11875093)
  8. Opti-MEM (Thermo, catalog number: 31985088)
  9. FBS (Biological Industries, catalog number: 04-001-1A)
  10. Trypsin-EDTA (0.25%) (Thermo, catalog number: 25200072)
  11. Penicillin/streptomycin (Thermo, catalog number: 15070063)
  12. Lipofectamine RNAiMAX reagent (Thermo, catalog number: 13778075)
  13. PFA (Sigma-Aldrich, catalog number: 158127)
  14. Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: 93443)
  15. BSA (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: 9048-46-8)
  16. DharmaFECT1 (Horizon，catalog number: T-2001-03)
  17. TOX (Thermo, catalog number: AM16708)

抗体

  1. YAP (63.7) antibody (Santa Cruz, catalog number: sc-1001199)
  2. Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse secondary antibody (Thermo, catalog number: A32723)
  3. DAPI (Sigma-Aldrich, catalog number: 28718-90-3)

细胞系
HGC-27细胞 (上海生命科学研究院细胞资源中心，TCHu 22)

仪器设备

  1. 离心式自动洗板机 (BlueCatBio，model: BlueWasher)
  2. Multidrop自动分液器 (Thermo Fisher，model: Multidrop Combi)
  3. Opera激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统 (Perkin Elmer，model: Opera LX488/561/640)
  4. Operetta高通量细胞成像分析系统 (Perkin Elmer，model: Operetta)
  5. 隔水式恒温培养箱 (上海精宏实验设备有限公司)
  6. 水平冷冻离心机 (Eppendorf，model: 5810R)
  7. 细胞计数仪 (Invitrogen，model: Countess)
  8. 二氧化碳恒温细胞培养箱 (Thermo Fisher，model: Thermo Series 8000)
  9. 电动移液器 (Eppendorf)
  10. Ensight多功能微孔板检测仪 (Perkin Elmer，model: Ensight)
  11. Bravo自动化液体处理平台 (Agilent，model: Bravo)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：汤扬, 焦石, 周兆才. (2021). 胃癌细胞中Hippo通路负调控因子筛选-YAP出入核检测. // 高内涵成像及分析实验手册. Bio-101: e1010822. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010822.
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How to cite: Tang, Y. Jiao, S. and Zhou, Z. C. (2021). Screening of Negative Regulators of Hippo Pathway in Gastric Cancer Cells with Nuclear Translocation of YAP as Readout. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook. Bio-101: e1010822. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010822.
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