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全基因组siRNA法筛选环形RNA的反式调控因子

Genome-wide siRNA Screen for trans-factors of Circular RNA Regulation

李 李响
陈 陈玲玲

发表时间: 2021年06月01日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010820 浏览次数: 2824

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高通量筛选实验手册
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摘要：环形RNA (circular RNA, circRNA) 主要是由前体RNA的外显子通过反向剪接产生的共价闭合的RNA分子。目前关于circRNA的表达调控和生物学功能仍不清楚。尽管已知部分顺式原件参与了circRNA的生成调控，但对于参与其中的反式因子仍知之甚少。为了全面评估与鉴定参与circRNA表达调控的反式因子，我们利用商业化的全基因组siRNA文库，结合生化细胞所化学生物学平台的高通量筛选平台，进行了全基因组siRNA筛选，最终鉴定到了103个参与circRNA表达调控的反式因子，并对其中鉴定到的两个蛋白NF90和NF110进行了深入的机制与功能研究。 这里，我们将详细介绍利用全基因组siRNA文库筛选circRNA表达调控反式因子的主要流程，包括筛选用细胞系的构建、全基因组siRNA文库筛选和数据分析流程。

Keywords: RNAi筛选 search circRNA search 反式因子 search RNA结合蛋白 search

材料与试剂

  1. HeLa细胞 (ATCC，产品目录号：CCL-2)
  2. HEK293细胞 (ATCC，产品目录号：CRL-1573)
  3. DMEM (GibcoTM, 产品目录号: 11965092)
  4. Fetal bovine serum (FBS) (GibcoTM, 产品目录号: 10270-106)
  5. 0.25% Trypsin (GibcoTM, 产品目录号: 27250018)
  6. Penicillin streptomycin (Hyclone, 产品目录号: SV30010)
  7. Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (GibcoTM, 产品目录号: 31985070)
  8. LipofectamineTM 3000 Reagent (Thermo, 产品目录号: 21341)
  9. LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo, 产品目录号: 13778030)
  10. Human ON-TARGETplus siRNA library –Genome- SMARTpool (Dharmacon)
  11. doxycycline (Dox) (Clontech, 产品目录号: #631311)
  12. psPAX2 (Addgene, 产品目录号: #12260)
  13. pMD2.G (Addgene, 产品目录号: #12259)
  14. 84消毒液
  15. Phosphate buffered saline (PBS) 缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 高内涵细胞成像分析仪Operetta (PerkinElmer，Operetta高内涵细胞分析系统)
  2. 自动化洗板机ELx405 (BioTek，ELx405 Select Deep Well Microplate Washer)
  3. 自动化分液仪 Multidrop Combi (Thermo Fisher，Multidrop Combi自动化分液仪)
  4. CO2培养箱 (Thermo Fisher，Heracell 150i)
  5. 水平离心机 (Beckman Coulter, model: Allegra X-12R)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：李响, 陈玲玲. (2021). 全基因组siRNA法筛选环形RNA的反式调控因子. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010820. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010820.
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How to cite: Li, X. and Chen, L. L (2021). Genome-wide siRNA Screen for trans-factors of Circular RNA Regulation. // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010820. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010820.
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