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小鼠脑切片原位杂交

In-situ Hybridization for Mouse Brain Sections

应 应玥
蔡 蔡予琦
吴 吴锦云
何苗 何苗

发表时间: 2021年08月10日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010818 浏览次数: 6731

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摘要：原位杂交 (In-situ hybridization, ISH) 可对组织细胞中的RNA进行定性检测。原位杂交的基本原理为：带有标记物的核酸探针通过碱基互补配对特异性结合组织细胞中的待测RNA，形成杂交体。杂交体被抗体识别后，经过显色反应，可直接在组织切片上观察到待测RNA的表达情况。本篇实验指南以地高辛 (DIG) 标记的核酸探针为例，介绍原位杂交的基本操作步骤。

Keywords: 原位杂交 search 碱基互补配对 search 抗原抗体结合 search 显色反应 search

材料与试剂

  1. 去离子水 (Milipore)
  2. 经焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理的去离子水
  3. 4%多聚甲醛 (PFA)
  4. 经DEPC处理的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) (pH 7.4-7.5)
  5. 20%, 30%蔗糖 (Invitrogen, catalog number: 15503-022) 溶液 (经DEPC处理的1× PBS配制)
  6. OCT包埋剂 (SAKURA, catalog number: 4583)
  7. 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) (BBI, catalog number: A600194-0500)
  8. 盐酸 (HCl) (生工，catalog number: 10011018)
  9. 三乙胺醇 (TEA) (1M) (VETEC, catalog number: V900257)
  10. 蛋白酶K (ThermoFisher, catalog number: 25530-049)
  11. 抗地高辛碱性磷酸酶 (Anti-DIG-AP) (Roche, catalog number: 11093275910)
  12. RNA探针
  13. 100%甲醇 (沪试，catalog number: 10014118)
  14. 封片剂 (碧云天，catalog number: P0126)
  15. 柠檬酸钠缓冲液 (SSC) (pH 7.0)
  16. PK缓冲液 (见溶液配方)
  17. 杂交溶液 (见溶液配方)
  18. 缓冲液B1 (见溶液配方)
  19. 缓冲液B2 (见溶液配方)
  20. 缓冲液B3 (见溶液配方)
  21. 缓冲液B4 (遮光贮存) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 冰冻切片机 (Leica, catalog number: CM1950) (图1A)
  2. 防卷板 (Leica, 14047742497)
  3. 量筒 (申玻)
  4. 杂交炉 (UVP，catalog number: HL-2000) (图1B)
  5. 桌面离心机 (Thermo Fisher，catalog number: 75002420) (图1C)
  6. 金属浴 (奥盛，catalog number: MK2000-2E) (图1D)
  7. 脱色摇床 (QILINBEIER，catalog number: TS-1) (图1E)
  8. 磁力搅拌器 (SCILOGEX，catalog number: MS7-H550-Pro)
  9. 水浴锅 (精宏，catalog number: DK-S24)
  10. 盖玻片 (Fisherbrand，catalog number: 12-544-E) (图2A) (或：Electron Microscopy Sciences，catalog number: 70329-60；或：LifterSlip，catalog number: 100499-626)
  11. 载玻片 (Fisherbrand，catalog number: 12-550-15) (图2B)
  12. 阻水笔 (ImmEdge，catalog number: H-4000) (图2C)
  13. 杂交盒 (LOCK & LOCK) (内置海绵) (图2D)
  14. 去离子水盒 (LOCK & LOCK) (内置海绵) (图2E)
  15. 塑料染色缸 (生工，E678012) (载玻片数量多时可用) 或50 ml离心管 (Thermo Fisher，339652) (载玻片数量少时可用) (图2F, G)
  16. 培养箱 (精宏，catalog number: SHP-250)


    图1. 实验所需仪器. (A) 切片机；(B) 杂交炉；(C) 离心机；(D) 金属浴；(E) 脱色摇床


    图2. 实验所需用品. (A) 盖玻片；(B) 载玻片；(C) 阻水笔；(D) 杂交盒；(E) 去离子水盒；(F) 塑料染色缸；(G) 50ml离心管

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：应玥, 蔡予琦, 吴锦云, 何苗. (2021). 小鼠脑切片原位杂交. Bio-101: e1010818. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010818.
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How to cite: Ying, Y., Cai, Y. Q., Wu, J. Y. and He, M. (2021). In-situ Hybridization for Mouse Brain Sections. Bio-101: e1010818. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010818.
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分类

神经科学 > 基础技术

分子生物学 > RNA > RNA 检测

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