研究背景

在秀丽隐杆线虫中，piRNA从基因组上转录出来，加工后会产生长约26 nt且带有5’cap的piRNA前体，经过5’端去帽，以及5’端剪切约2个核苷酸，和3’端剪切等加工步骤，生成长21 nt的成熟piRNA，也称21U-RNA，并与PIWI蛋白PRG-1结合(Batista et al., 2008; Gu et al., 2012; Weick and Miska, 2014; Weng et al., 2019)。为了研究线虫中piRNA的生成过程，需要对piRNA前体进行检测和分析。在small RNA-seq中，需要RNA的5’端是单磷酸，才可以加linker进而反转录建库测序。在检测不同结构类型的piRNA前体的时候，需要用不同的RNA加工酶进行处理，将5’端转变为单磷酸 (图1) (Gu et al., 2012; Cordeiro Rodrigues et al., 2019; Zeng et al., 2019)。本方案对带有5’cap的piRNA前体和不带有5’cap但长于21 nt的piRNA前体进行分析。


图1. 加工酶对不同类型small RNA的加工模式

材料与试剂

一、生物材料

1. 秀丽隐杆线虫（实验室培养）
2. 大肠杆菌OP50（实验室培养）

1. RNase-free离心管50 ml（Corning, catalog number:430828），15 ml（Corning, catalog number:430791），1.5 ml（Nest, catalog number:615001）
2. 普通离心管15 ml，50 ml
3. RNase-free枪头1000 μl，200 μl，20 μl，10 μl（Axygen, catalog number: TF-1000-R-S, TF-200-R-S, TF-20-R-S, TF-10-R-S）
4. 一次性口罩
5. 一次性培养皿直径90 mm，60 mm，35 mm (培养线虫用)

1. MgSO₄ (Sangon Biotech, catalog number: A601988)
2. NaCl (Sangon Biotech, catalog number: A610476)
3. Na₂HPO₄ (Sangon Biotech, catalog number: A501727)
4. KH₂PO₄ (Sangon Biotech, catalog number: A100781)
5. NP-40 (Sangon Biotech, catalog number: A800385)
6. Tris (Sangon Biotech, catalog number: A600194)
7. NaOH (Sangon Biotech, catalog number: A100583)
8. NaClO (国药, catalog number:7681-52-9)
9. MgCl₂ (Sangon Biotech，catalog number: A100288)
10. 10x M9 (配方见表1)
    
    表1.
    

    	Total 1000 ml
    NaCl	50 g
    Na2HPO4	60 g
    KH2PO4	30 g
    ddH20	990 ml
    上述试剂配置完，使用灭菌锅进行120 °C 20min高压灭菌，待溶液冷却后，再加入10 ml 1 M MgSO4

    注：用ddH₂O稀释10x M9 10倍，配置成1x M9使用。
    
    
11. 2x bleach液 (配方见表2)
    
    表2. 
    

    	Total 200 ml
    10 M NaOH	20 ml
    NaClO溶液(活性氯>=5.2%)	80 ml
    ddH2O	ml

    
    
12. DEPC-treated water (Sangon Biotech，catalog number: B50100，预冷)
13. TRIzol (Life technologies，catalog number: 15596026，预冷)
14. Chloroform，氯仿 (索莱宝，catalog number: P1014预冷)
15. 75%乙醇 (100%乙醇:DEPC-treated water 3:1，预冷)
16. Isopropanol，异丙醇 (Sangon Biotech, catalog number: A507048，预冷)
17. RNase inhibitor (Thermo fisher, catalog number: EF0651, storage at -20 °C)
18. DNase I (Thermo fisher, catalog number:18047019, storage at -20 °C)
19. CIAP (Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal，小牛肠道碱性磷酸酶，Invitrogen, catalog number: 18009019, storage at -20 °C) 或者FastAP (Thermo fisher, catalog number: EF0651, storage at -20 °C)
20. RppH (RNA 5’焦磷酸水解酶，Enzymax, catalog number: 88, storage at -80 °C) 或者Tabacco decapping plus 2 (Enzymax, catalog number: 94, storage at -80 °C)

1. 超声破碎管 (Invitrogen, catalog number: Q3285)
2. 裂解缓冲液(配方见表3)
   
   表3.
   

   	stock	Total 500 ml
   0.5% NP-40		2.5 ml
   20 mM Tris pH 7.5	1 M	10 ml
   200 mM NaCl	5 M	20 ml
   2.5 mM MgCl2	1 M	1.25 ml
   10% glycerol		50 ml
   DEPC-treat water		补齐至500 ml

   注：10% glycerol 可稍微加热后量取，裂解缓冲液存放于RNase-free处理的玻璃试剂瓶中，存放于4 °C。

仪器设备

一、实验器皿

1. 玻璃瓶 1000 ml，500 ml，250 ml，100 ml
2. 塑料量筒 500 ml，200 ml，100 ml
3. 玻璃移液管15 ml，25 ml

1. 摇床 (海门其林贝尔, TS-8)
2. 冷冻离心机 (Eppendorf, 5415R)
3. 普通离心机 (Eppendorf, Centrifuge 5702)
4. 37°C烘箱 (上海智诚，ZDP-2120)
5. 冰箱 (20 °C，4 °C，-20 °C，-80 °C)
6. Vortex (IKA，Vortex2)
7. 超声破碎仪 (Diagenode，Bioruptor UCD-200)
8. 体式显微镜 (MOTIC，SMZ168)
9. 电子秤 (梅特勒，AL104)
10. 高温高压灭菌锅 (致微，G154DWS)
11. 电子移液枪 (Eppendorf)
12. 移液枪 (Brand，1000 μl，200 μl，20 μl，2 μl)
13. 真空泵 (海门其林贝尔，GL802B)

实验步骤