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利用RNA免疫共沉淀以及RT-qPCR实验验证MDA-MB-231-LM2细胞中LDHA蛋白与非编码RNA LINC00973的相互作用

Detecting the Interaction between non-coding RNA LINC00973 and LDHA Protein in MDA-MB-231-LM2 Cells by RNA Immunoprecipitation and RT-qPCR

朱 朱林*
王 王会丽*
王 王栋

*Contributed equally to this work 发表时间: 2022年09月27日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010809 浏览次数: 1640

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摘要：RNA免疫共沉淀技术 (RNA Immunoprecipitation，RIP) 是研究细胞内蛋白质与RNA结合情况的技术 (Gilbert and Svejstrup, 2006)。RIP技术的原理是利用针对靶蛋白的特异性抗体，把相应的靶蛋白以及与靶蛋白结合的RNA一起沉淀下来，然后通过分离纯化等步骤就可以得到与靶蛋白结合的RNA，结合RT-qPCR便可以用来验证某RNA是否能与靶蛋白结合(Gagliardi and Matarazzo, 2016)。本实验利用RIP技术，结合RT-qPCR实验方法，来探究三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231-LM2中LDHA蛋白与非编码RNA LINC00973是否存在相互作用。通过对实验结果的分析，我们得出在MDA-MB-231-LM2细胞中，LDHA蛋白与非编码RNA LINC00973存在相互作用的结论。

Keywords: RNA免疫共沉淀技术 search RT-qPCR search

研究背景

随着对蛋白质功能研究的深入，越来越多的蛋白质被发现具有RNA结合能力。RIP实验可帮助我们快速确定靶蛋白能否结合我们感兴趣的目的RNA。通过靶蛋白的特异性抗体，我们可以将结合在靶蛋白上的RNA与靶蛋白和抗体一同沉淀下来。之后收集沉淀物，再消化去除蛋白质，便可得到靶蛋白结合的RNA。随后我们通过RT-qPCR实验分析我们感兴趣的目的RNA是否在总RNA里富集，便能确定我们感兴趣的目的RNA是否特异性结合靶蛋白。相比于其他基于蛋白去鉴定互作RNA的技术，如CLIP-seq等，RIP实验具有实验流程短、操作简便易上手、花费少等优点，是我们研究蛋白质与RNA互作常用的技术。本文结合我们实验室已发表的文章，通过利用RIP技术验证在乳腺癌细胞系MDA-MB-231-LM2中LDHA蛋白与非编码RNA LINC00973的相互作用这一例子，具体阐述RIP实验的操作流程与分析方法(Wang et al., 2021)。

材料与试剂

  1. 100 mm细胞培养皿
  2. 胰酶 (Thermo Fisher, catalog number: 25200072)
  3. 冰盒
  4. Protein A + G磁珠 (Millipore, catalog number: 16-663)
  5. LDHA抗体 (Proteintech, catalog number: 21799-1-AP)
  6. IgG抗体 (CST, catalog number: 2729S)
  7. RNasin ribonuclease inhibitor (Promega, catalog number: N2511)
  8. 蛋白酶K (Roche, catalog number: 3115879001)
  9. Tris-HCl (pH = 7.5, Invitrogen, catalog number: 15567027)
  10. NaCl (国药，catalog number: 10019318)
  11. SDS (Macklin, catalog number: S817788-500G)
  12. NP-40 (Macklin, catalog number: N885725-100 mL)
  13. EDTA (Amresco, catalog number: 0322-1KG)
  14. PMSF (碧云天，catalog number: ST506)
  15. DTT (Amresco, catalog number: 0281)
  16. Protease inhibitor cocktail (Amresco, catalog number: M221-1ML)
  17. UltraPureTM DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen, catalog number: 10977023)
  18. 1x PBS缓冲液 (Hyclone, catalog number: SH30256.01)
  19. TRIzol (Invitrogen, catalog number: 15596018)
  20. 氯仿 (国药, catalog number: 67-66-3)
  21. 异丙醇 (国药, catalog number: 67-63-0)
  22. 无水乙醇 (国药, catalog number: 64-17-5)
  23. 5x RIP缓冲液 (见溶液配方)
  24. 细胞裂解缓冲液 (见溶液配方)
  25. 蛋白酶K缓冲液 (pH = 7.5) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液器
  2. 移液器枪头 (DNase free, RNase free)
  3. 1.5 ml EP管 (DNase free, RNase free)
  4. 磁力架
  5. 4 °C冰箱
  6.  -80 °C冰箱
  7. 恒温金属震荡仪
  8. 4 °C离心机
  9. 旋转混匀仪 (EASYBIO, catalog number: BE-1100)
  10. 荧光定量PCR仪（LightCycler96，Roche）

实验步骤

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：朱林, 王会丽, 王栋. (2022). 利用RNA免疫共沉淀以及RT-qPCR实验验证MDA-MB-231-LM2细胞中LDHA蛋白与非编码RNA LINC00973的相互作用. Bio-101: e1010809. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010809.
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How to cite: Zhu, L., Wang, H. L. and Wang, D. (2022). Detecting the Interaction between non-coding RNA LINC00973 and LDHA Protein in MDA-MB-231-LM2 Cells by RNA Immunoprecipitation and RT-qPCR. Bio-101: e1010809. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010809.
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