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细胞RNA Pulldown实验——利用体外合成带生物素标记的RNA检测细胞裂解液中与目标RNA互作的蛋白的方法

RNA Pulldown Assay

桑 桑凌杰
瞿 瞿蕾
陈 陈怡君
林 林爱福

发表时间: 2022年09月15日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010807 浏览次数: 2061

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摘要：RNA能结合特定的蛋白质，从而引起蛋白质电荷改变、空间结构变化等进而影 响蛋白质的功能。对RNA的特异性结合蛋白的鉴定是了解RNA功能的重要途径。 RNA pull down实验是一种鉴定RNA结合蛋白的实验方法。使用体外转录法标记生物 素RNA，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素偶联的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离；复合物洗脱后，通过Western Blot 实验检测待定的RNA结合蛋白是否与RNA互相作用。使用该方案还可以联合蛋白质谱技术，实现RNA结合蛋白的系统筛选与鉴定。

Keywords: RNA pull down search RNA蛋白结合 search 生物素标记RNA search RNA-蛋白互作 search

材料与试剂

  1. 1.5 ml EP管 (上海生工生物，catalog number: F601620-9001)
  2. cOmpleteTM, Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche, catalog number: 04693124001) 
  3. 5x SDS loading buffer (Beyotime，P0015L) 
  4. Biotin RNA labeling mix: (Roche, catalog number: 11685597910) 
  5. MEGAscriptTM SP6/T7 Transcription Kit (InvitrogenTM, catalog number: AM1330/ AM1333) 
  6. DynabeadsTM M-280 Streptavidin (InvitrogenTM, catalog number: 11206D) 
  7. Tris-HCl (上海生工生物，catalog number:B041188) 
  8. KCl (国药，CAS 7447-40-7) 
  9. MgCl2 (麦克林，CAS 7786-30-3) 
  10. DTT (北京索莱宝科技有限公司，CAS 3483-12-3) 
  11. NP-40 (Beyotime, catalog number: P0013F) 
  12. Na2HPO4·12H2O (国药集团化学试剂有限公司 CAS 10039-32-4) 
  13. KH2PO4 (国药集团化学试剂有限公司 CAS：7778-77-0) 
  14. DNase I (Invitrogen，catalog number:AM2238) 
  15. EDTA (Sigma，catalog number:E9884) 
  16. RNA Clean and Concentrator-5 kit (Zymo Research，catalog number:R1013)
  17. BCA定量蛋白试剂盒 (Beyotime，catalog number:P0009) 
  18. RIP buffer (见溶液配方) 
  19. NT2 buffer (见溶液配方) 
  20. NT2 high salt buffer (见溶液配方) 
  21. 10x PBS buffer (见溶液配方)

仪器设备

  1. 小型低温离心机
  2. 移液器
  3. 移液枪
  4. 磁力架
  5. 旋转仪
  6. 伯乐电泳仪
  7. 伯乐转膜仪
  8. 恒温金属浴震荡仪

实验步骤

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：桑凌杰, 瞿蕾, 陈怡君, 林爱福. (2022). 细胞RNA Pulldown实验——利用体外合成带生物素标记的RNA检测细胞裂解液中与目标RNA互作的蛋白的方法. Bio-101: e1010807. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010807.
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How to cite: Sang, L. J., Qu, L., Chen, Y. J. and Lin, A. F. (2022). RNA Pulldown Assay. Bio-101: e1010807. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010807.
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