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利用"点击化学"捕获新转录RNA的结合蛋白

Capturing the RNA Binding Proteins of Newly Transcribed RNA by Click Chemistry

林 林莹莹*
王 王茜玮*
鲍 鲍习琛

*Contributed equally to this work 发表时间: 2022年09月15日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010806 浏览次数: 1678

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摘要: RNA分子发挥功能需要RNA结合蛋白 (RNA binding proteins, RBPs) 的直接相互作用和协助，RNA结合蛋白参与RNA分子的多种代谢调控，特别是转录后水平的调控 (Gerstberger et al., 2014; Hentze et al., 2018)。前期针对系统捕获细胞内RBPs的方法，主要是通过oligo (dT) 包被的磁珠捕获与polyA尾RNA结合的RBPs (Castello et al., 2012; Baltz et al., 2012)，而对于与非polyA尾RNA (如新转录RNA) 结合的RBPs的分离研究甚少。我们利用带有炔基修饰的尿嘧啶核苷类似物——5-乙炔基-2'尿嘧啶核苷 (5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EU) 标记HeLa细胞，通过UV交联RNA与RBPs后，再利用"点击化学" (Click Chemistry) 反应将EU标记的RNA分子与含有叠氮修饰的生物素连接起来，最后通过链霉亲和素磁珠捕获RNA与RBPs复合物 (实验流程见图1)。我们利用此方法在HeLa细胞中成功分离了720个高可信度的RBPs；另外，新生RNA转录过程中会发生很多偶联事件如修饰、剪切等，我们通过缩短EU标记的时间 (0.5 h、1 h、2 h)，完成新生RNA结合蛋白的捕获 (捕获效率见图2)，成功鉴定到208个与新生RNA结合的RBPs (Bao et al., 2018)。此方法为捕获在不同生理病理模型中RNA结合蛋白组以及研究其功能提供了很好的技术平台。


图1. 利用"点击化学"捕获新转录RNA的结合蛋白的实验流程


图2. 通过实时荧光定量PCR检测短时间以及16小时EU标记后的RNA捕获效率

Keywords: RNA search RNA结合蛋白 search 点击化学 search 蛋白质组学 search

材料与试剂

  1. 低吸附离心管 (Eppendorf，catalog number: 30108051) 
  2. HeLa细胞 (ATCC, catalog number: CCL-2TM) 
  3. 胎牛血清 (NTC，catalog number: SFBE) 
  4. DMEM高糖培养基 (Hyclone，catalog number: SH30022.01) 
  5. 1x DPBS basic (Dulbecco's phosphate-buffered saline, Gibco, catalog number: C14190500BT)
  6. 无RNase/DNase超纯蒸馏水 (Thermo，catalog number: 10977023) 
  7. 5-乙炔基尿苷 (5-ethynyluridine，EU；Ribobio，catalog number: C00065) (溶于DMSO配制为0.1 M的母液，可避光保存于-20 °C长达半年) 
  8. 叠氮修饰生物素 (Biotin-azide, Ribobio, catalog number: C00101-50mg) (溶于DMSO配制为0.25 M的母液，可保存于-20 °C长达半年) 
  9. 乙醇 (西陇科学，574，catalog number: 64-17-5) 
  10. TritonX-100 (Sigma-Aldrich，catalog number: T9284) 
  11. 硫酸铜 (CuSO4，Sigma-Aldrich，catalog number: 451657) (溶于无RNase/DNase超纯蒸馏水配制为0.5 M的母液，现配现用) 
  12. 三 (3-羟丙基三氮基甲基) 胺 (Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine THPTA；Sigma-Aldrich，catalog number: 762342) (溶于DMSO配制为0.25M的母液，可避光保存于-20 °C长达半年) 
  13. 氨基胍盐酸盐 (Aminoguanidine，Sigma-Aldrich，catalog number: 396494) (溶于无RNase/DNase超纯蒸馏水配制为0.5 M的母液，可避光保存于-20 °C长达半年) 
  14. (+)-抗坏血酸钠L (Sodium L-ascorbate，Sigma-Aldrich，catalog number: 11140) (溶于DPBS配制为0.1 M的母液，现配现用) 
  15. 1 M Tris-HCl，pH7.5 (Invitrogen，catalog number: 15567-027) 
  16. 氯化锂 (LiCl；Sigma-Aldrich，catalog number: 62476) 
  17. 十二烷基硫酸锂 (LiDS；Sigma-Aldrich，catalog number: L9781) 
  18. DL-二硫苏糖醇 (DTT；Sigma-Aldrich，catalog number: D0632) 
  19. 无EDTA-蛋白酶抑制剂 (Roche，catalog number: 04693132001) 
  20. RNA酶抑制剂 (RRI； TaKaRa， catalog number: 2313A) 
  21. 链霉亲和素磁珠 (Thermo Fisher Scientific，catalog number: 65602) 
  22. 甲酰胺 (Sigma-Aldrich，catalog number: 47671) 
  23. 1 M Tris-HCl，pH 7.0 (Invitrogen，catalog number: AM9851) 
  24. 蛋白酶K (New England Biolabs，catalog number: P8107S) 
  25. RNase A (Sigma-Aldrich，catalog number: R4875) 
  26. TRI Reagent试剂 (MRC，catalog number: TR-118-200) 
  27. 氯仿 (美国CIL，catalog number: 865-49-6) 
  28. 异丙醇 (大茂，PG13302，catalog number: 67-63-0) 
  29. 糖原 (Roche，catalog number: 10901393001) 
  30. 5 M NaCl溶液 (Invitrogen，catalog number: AM9759)
  31. 青霉素-链霉素双抗溶液 (Hyclone，catalog number: SV30010)
  32. 10% 十二烷基硫酸钠溶液 (10% SDS；Invitrogen，catalog number: 24730020)
  33. 0.5 M EDTA溶液，pH 8.0 (Invitrogen，catalog number: 15575020)

仪器设备

  1. 10厘米 (cm) 细胞培养皿 (Greiner，catalog number: 664160) 
  2. 二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific，catalog number: 4111) 
  3. 无菌超净工作台 (ESCO，catalog number: ACB-4A1) 
  4. 紫外交联仪 (新芝，catalog number: SCIENTZ 03-II) 
  5. 胰岛素注射器 (BD，catalog number: 328421) 
  6. 2毫升 (ml) 免疫磁珠磁力架 (invitrogen，catalog number: 12321D) 
  7. 垂直混匀仪 (新芝，catalog number: HS-3) 
  8. 小型冷冻离心机 (Eppendorf，catalog number: 5424R) 
  9. 振荡型恒温金属浴 (博日，catalog number: MB-102) 
  10. 转移脱色摇床 (其林贝尔，catalog number: TS-8S) 
  11. 细胞刮 (Greiner，catalog number: 541070)

实验步骤

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：林莹莹, 王茜玮, 鲍习琛. (2022). 利用"点击化学"捕获新转录RNA的结合蛋白. Bio-101: e1010806. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010806.
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How to cite: Lin, Y. Y., Wang, Q. W. and Bao, X. C. (2022). Capturing the RNA Binding Proteins of Newly Transcribed RNA by Click Chemistry. Bio-101: e1010806. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010806.
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