研究背景

随着对RNA功能研究的深入，人们发现许多RNA通过结合特定的蛋白质并影响其结构和功能来发挥作用。所以，鉴定RNA结合蛋白能够帮助我们更好地研究RNA的功能。目前，常用的鉴定RNA结合蛋白的方法有RNA pull down、ChIRP (Chromatin Immunoprecipitation by RNA Purification) (Chu et al., 2012)、dChIRP (domain-specific chromatin isolation by RNA purification) (Quinn et al., 2014) 等技术，其中，RNA pull down技术的应用最为广泛。RNA pull down实验首先将体外合成带有生物素标记的RNA与细胞裂解液进行孵育，接着用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的RNA，同时获得RNA-靶蛋白复合体。最后通过质谱或Western Blot等蛋白质鉴定方法，我们就可以确定该RNA的结合蛋白。和其他技术相比，RNA pull down技术操作简单、耗时短、花费少，因此被广泛使用。掌握RNA pull down实验技术，可以帮助我们更好地研究RNA的功能。本文结合本实验室已发表的文章，详细阐述RNA pull down实验的操作过程与结果分析 (Wang et al., 2021)。

材料与试剂

1. 移液器枪头 (DNase free，RNase free) 
2. 1.5 ml EP管
3. 100 mm细胞培养皿
4. 冰盒
5. 200 µl PCR管 (QSP，catalog number: 431-Q) 
6. 链霉亲和素磁珠 (Pierce，catalog number: 88817)
7. T7 RNA Polymerase Riboprobe® Systems (Promega，catalog number: P1440) 
8. Biotin-16-UTP (Roche，catalog number: 11388908910) 
9. 生物素 (thermo，catalog number: B20656) 
10. Tris-HCl (pH = 7.5，thermo，catalog number: 15567027) 
11. NaCl (国药，catalog number: 10019318) 
12. SDS (Macklin，catalog number: S817788-500G) 
13. NP-40 (Macklin，catalog number: N885725-100 ml) 
14. tRNA (Invitrogen，catalog number: AM7119) 
15. HEPES (Amresco，catalog number: 0485-25G) 
16. EDTA (Amresco，catalog number: 0322-1KG) 
17. Sarkosyl (Macklin，catalog number: D885916-100 ml) 
18. 脱氧胆酸钠 (国药，catalog number: 69022780) 
19. DTT (Amresco，catalog number: 0281) 
20. Protease inhibitor cocktail (Amresco，catalog number: M221-1ML) 
21. RNasin ribonuclease inhibitor (Promega，catalog number: N2511) 
22. BSA (Sigma，catalog number: A1470-25G) 
23. 1x PBS缓冲液 (Hyclone，catalog number: SH30256.01) 
24. PMSF (碧云天，catalog number: ST506) 
25. UltraPure^TM DNase/RNase-Free Distilled Water，超纯水 (Invitrogen，catalog number: 10977023) 
26. RNase喷雾清除剂 (Vazyme，catalog number: R504-01) 
27. LDHA一抗 (Sigma, catalog number: ab14123)
28. 5x RIP缓冲液 (见溶液配方) 
29. 细胞裂解缓冲液 (见溶液配方) 
30. 生物素洗脱液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器
2. 磁力架
3. 水浴锅
4. 4 °C冰箱
5. -80 °C冰箱
6. 恒温金属浴震荡仪
7. 4 °C离心机
8. Nanodrop分光光度计
   

实验步骤