研究背景

R-loop是转录过程中新生RNA链与模板DNA链退火形成的杂合链结构与非模板DNA链共同形成的三链结构。此结构广泛存在于细菌、真菌和动植物基因组中，参与众多生理学过程。例如脊椎动物B细胞的免疫球蛋白类别转换重组 (CSR) (Yu et al., 2003)，CRISPR-Cas9基因编辑 (Jinek et al., 2012)，或者线粒体DNA、细菌和噬菌体的ColE1和T4复制起始、以及转录起始和终止等过程。目前领域认为R-loop富集在基因转录的起始区域和终止区 (Aguilera and Garcia-Muse, 2012)。除上述生理性R-loop，还存在着非程序性调控的病理性R-loop，它们会对基因组的稳定性造成了巨大的破坏，例如敲低细胞剪切复合物成员OCMG1会导致R-loop失调并诱发DNA双链断裂 (DSB)，γH2AX荧光信号显示DNA损伤和复制叉阻遏相关，重要的是过表达RNase H会抑制γH2AX聚集 (Houlard et al., 2011)，此外R-loop还会导致转录复制冲突 (Boubakri et al., 2010)，这些结果显示转录会通过R-loop影响双链断裂 (DSB) 修复等。因此准确定位基因组中R-loop，了解R-loop在不同环境和细胞周期条件下与转录、复制和表观特征等过程关联的分子基础，将有助于我们更好理解染色质功能调控对基因组稳定性维持和疾病发生的重要作用。
现阶段定位基因组中R-loop的方法主要是依赖S9.6抗体的DRIP-seq以及多种衍生技术 (Xu et al., 2017)。该类方法的原理是利用S9.6抗体特异性识别R-loop的特性，在体外富集限制酶消化后的基因组片段，并对富集到的R-loop结构进行建库及高通量测序。由于采用限制酶对DNA进行片段化，DRIP-seq信号范围在5 kb左右，分辨率较低，不能精确定位R-loop的分布；并且越来越多文献报道S9.6抗体不仅可以识别杂合链结构，还可以非特异性结合双链RNA结构，从而会造成文库信息不准确等问题。基于以上问题，我们利用不同原理开发了新的基因组R-loop定位技术。RNase H1蛋白是哺乳动物中重要的R-loop调控蛋白，由N端杂合链结合结构域 (HBD) 和C端内切酶基序组成，可以降解杂合链结构中的RNA链，调节体内R-loop动态。研究表明RNase H1 第210位的天冬氨酸 (D) 突变为天冬酰胺 (N) 可以使酶活性丧失，但是不改变其与底物结合能力，因此可以作为杂合链靶向蛋白。R-ChIP便是通过在体内过表达RNase H1 D210N突变体，由其靶向杂合链结构，再利用超声的方法进行片段化，然后富集RNase H1结合序列，对其进行链特异性建库 (Chen et al., 2017)。该方法相较于依赖S9.6抗体建库的方法更加真实的反映了体内R-loop的分布，将分辨率提高到200-300 bp，并且链特异性建库的方法可以获得链方向性的信息从而判断转录方向。但是体内过表达RNase H1可能在一定程度上影响细胞内R-loop稳态，并且对于组织中的应用需要先建立转基因模型，因此需要根据实验需求选择合适的方法。

材料与试剂

1. PpyCAG-RNaseH1-D210N (Addgene, catalog number: 111904)
2. 甲醛 (Sigma-Aldrich, catalog number: 252549-100ML)
3. 甘氨酸 (Sigma-Aldrich, catalog number: G7126-500G)
4. Lipo2000 (Thermo Fisher, catalog number: 11668-030)
5. 潮霉素B (Thermo Fisher, catalog number: 10687010)
6. RNase A (Thermo Fisher, catalog number: EN0531)
7. 蛋白酶K (New England Biolabs, catalog number: P8107S)
8. DNA提取酚 (Solarbio, catalog number: T0250)
9. DNA提取试剂 (25:24:1, pH 8.0, Solarbio, P1012)
10. 蛋白酶抑制剂 (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma, catalog number: S8830-20TAB)
11. Deoxycholate (Sigma-Aldrich, catalog number: D6750-25G)
12. Glycogen (Thermo Fisher, catalog number: FERR0561)
13. Protein A/G磁珠 (Thermo Fisher, catalog number: PI88802)
14. V5抗体 (ChIP Grade, Abcam, catalog number: ab9116)
15. RNA酶抑制剂 (Thermo Fisher, catalog number: FEREO0382)
16. Klenow DNA polymerase (New England Biolabs, catalog number: M0210S)
17. Klenow fragment 3'-5' exo- (New England Biolabs, catalog number: M0212S)
18. 3'Random N9 primer/OligoA/OligoB (Takara)
    N9 random primer：5ʹ-/invddt/CAAGCAGAAGACGGCAT ACGAGNN NNNNNNN-3ʹ;
    Oligo A：5ʹ-/Phos/GATCGGAAGAGCGTC GTGTAGGGAAAGAGTGT-3ʹ;
    Oligo B：5ʹ-AGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3ʹ;
19. PCR文库扩增引物
    Primer F：5ʹ-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG -3ʹ
    Primer R：5ʹ-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNACACTCTT TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3ʹ (NNNNNN为barcode序列)
20. PureLink PCR Micro Kit (Thermo Fisher, catalog number: K310050)
21. Phase-block gel tube-light (Tiangen, catalog number: WM5-2302820)
22. dATP (New England Biolabs, catalog number: N0440S)
23. dNTP (New England Biolabs, catalog number: N0447S)
24. T4 DNA ligase (New England Biolabs, catalog number: M0202S)
25. Phusion DNA polymerase (New England Biolabs, catalog number: M0530S)
26. PureLink Quick Gel Extraction Kit (Thermo Fisher, catalog number: K210012)
27. Beads wash buffer (见溶液配方)
28. Antibody binding buffer (见溶液配方)
29. Beads blocking buffer (见溶液配方)
30. Cell lysis buffer (见溶液配方)
31. Nuclear extract buffer (见溶液配方)
32. TE buffer (见溶液配方)
33. Elution buffer (见溶液配方)
34. Wash buffer I (见溶液配方)
35. Wash buffer II (见溶液配方)
36. Wash buffer III (见溶液配方)
37. Annealing buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液枪 (Rainin, catalog number: 17014388, 17014391, 17014382)
2. 恒温混匀仪 (Eppendorf, ThermoMixer C, catalog number: 5382000023)
3. 超声破碎仪 (Bioruptor Plus; Diagenode, model no. B01020001)
4. 冷冻离心机 (Eppendorf, model no. 5804R)
5. -80 °C冰箱 (FORMA 900 series, Thermo Fisher, model no. 989)
6. -20 °C冰箱 (Panasonic, Model no. BZ10145190)
7. 旋转摇床 (BenchRocker 2D Rocker; Benchmark Scientific, model no. BR2000)
8. 金属浴锅 (上海一恒, catalog number: BWS-20)
9. 电泳仪及电源 (六一DYY-6C/7C/8C高压双稳定时电泳仪)
10. 磁力分离架 (Monad, model no. GS50401)
11. Qubit荧光光度计 (Thermo Fisher, model no. Q32857)
    

实验步骤