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RNA上N6-腺嘌呤甲基化 (m6A) 修饰的检测

Identification of N6-methyladenosine (m6A) in RNA

陈 陈丽倩
陈 陈鸿萱
骆 骆观正

发表时间: 2022年09月15日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010802 浏览次数: 2743

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摘要：RNA是体现细胞生命活动的重要载体，通过转录和转录后调控的方式对遗传信息进行解码和重编码，并参与到细胞的生长代谢中 (Shi et al., 2019)。RNA上有超过150种修饰，N6-甲基化腺嘌呤 (m6A) 是真核生物mRNA上修饰含量最多的一种，它在基因表达调控中发挥重要作用 (Yang et al., 2018)，影响了胚胎发育、神经元调节和肿瘤发生等多个生物学过程 (Barber and Rastegar, 2010; Chen et al., 2019)。而甲基化往往是一个动态的、可逆的过程，受到多种其它生物化学过程的调节 (Fu et al., 2014; Duan et al., 2019)。准确全面解析m6A的定位和丰度信息对于了解m6A的分布规律和生物学功能有很大的研究和应用价值。然而，由于方法学的限制，我们目前对m6A在全转录组上的分布情况了解有限 (Hartstock and Rentmeister, 2019; Zhao et al., 2020)。普通未修饰的A碱基与m6A碱基的化学结构差别不大，并不影响碱基配对方式 (图1)，所以通常很难通过常规的分子生物学方法进行区分。Dot-blot (斑点印记杂交法) 是一种基于抗体的修饰检测方法，可以方便快捷地判断RNA样品中总体m6A修饰的含量 (Shu et al., 2020; Wang et al., 2020)。相对于质谱来说，该方法价格成本更低，操作和分析都更加简单。同时，为了实现单个位点的m6A检测和定量，本实验中我们使用了T3连接酶法和MazF核酸内切酶法 (Liu et al., 2018; Zhang et al., 2019)，这两种方法具有操作简便，成本低和灵敏度高的特点，其中MazF核酸内切酶法还可以运用于高通量的转录组m6A位点的检测当中 (Zhang et al., 2019)。

Keywords: 哺乳动物细胞 search 总RNA提取 search HEK293T细胞 search m6A修饰 search Dot-blot search 抗体 search T3连接酶法 search 单个位点 search MazF酶 search

材料与试剂

  1. 无酶枪头 (QSP)
  2. 1.5 ml无酶EP管 (生工) 
  3. 50 ml无酶离心管 (生工) 
  4. 抗体孵育盒 (生工) 
  5. 双面胶
  6. 尼龙膜 (GE) 
  7. 无酶PCR管 (Axygen) 
  8. HEK293T细胞系
  9. m6A抗体 (Synaptic Systems, catalog number: 202003)
  10. 兔二抗 (CST) 
  11. TRIzol (TAKARA) 
  12. 氯仿 (广州牌) 
  13. 异丙醇 (生工) 
  14. 无水乙醇 (生工) 
  15. DEPC处理水 (生工) 
  16. 无菌1x PBS (生工) 
  17. Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher) 
  18. BSA粉末 (生工) 
  19. 1x TBS (生工) 
  20. Tween-20 (生工) 
  21. 100x亚甲蓝染液 (生工) 
  22. RNA 寡聚核苷酸链(TAKARA)
    m6A-UUGGUUUUUUUUGG(m6A)CAUGUAUAUAGU-FAM
    A-UUGGUUUUUUUUGGACAUGUAUAUAGU-FAM 
  23. T3 DNA连接酶 (NEB) 
  24. 10x T3连接缓冲液 (NEB) 
  25. 2x Taq Mix (Vazyme Biotech)
  26. 0.5x TAE (生工) 
  27. 琼脂粉 (生工) 
  28. gel-red核酸染料 (Genestar) 
  29. MazF酶 (Takara Bio Inc., catalog number: 2415A) 
  30. 5x MazF buffer
  31. 化学发光液 (BD) 
  32. 0.5x TBE (生工) 
  33. 尿素 (生工) 
  34. 5x TBE (生工) 
  35. 30%丙烯酰胺 (生工) 
  36. 过硫酸铵(APS)粉末 (生工) 
  37. 四甲基乙二胺(TEMED) (生工) 
  38. 1%亚甲蓝染液 (见溶液配方) 
  39. 75%乙醇 (见溶液配方)
  40. 0.1%TBST (见溶液配方)
  41. 3%BSA (见溶液配方)
  42. 1%亚甲蓝染液 (见溶液配方)
  43. 2.5%琼脂糖凝胶 (见溶液配方)
  44. 10%尿素-聚丙烯酰胺胶 (见溶液配方)
  45. 10% APS (见溶液配方)

仪器设备

  1. 剪刀
  2. 96孔PCR管架
  3. 镊子
  4. 100 ml小烧杯 (生工) 
  5. 低温高速离心机 (Eppendorf) 
  6. 低速离心机 (Eppendorf) 
  7. 移液枪 (Eppendorf) 
  8. 离心管架 (生工) 
  9. 通风橱
  10. 水平电泳系统 (Bio-Rad) 
  11. NanoDrop或Qubit 2.0 (Thermo Fisher) 
  12. 紫外交联仪 (Agilent) 
  13. 化学发光仪 (Bio-Rad) 
  14. 干式恒温器 (杭州瑞诚) 
  15. 水平摇床 (Kylin-bell其林贝尔 ) 
  16. PCR仪 (Thermo Fisher) 
  17. 凝胶成像仪 (Bio-Rad) 
  18. 电子天平
  19. 微波炉 (美的) 
  20. 垂直电泳系统 (Bio-Rad) 
  21. 恒温磁力搅拌器

软件

  1. Agilent Bioanalyzer

实验步骤

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：陈丽倩, 陈鸿萱, 骆观正. (2022). RNA上N6-腺嘌呤甲基化 (m6A) 修饰的检测. Bio-101: e1010802. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010802.
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How to cite: Chen, L. Q., Chen, H. X. and Luo, G. Z. (2022). Identification of N6-methyladenosine (m6A) in RNA. Bio-101: e1010802. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010802.
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