研究背景

环境DNA技术是近年来新兴的一种生物多样性调查方法，可以通过分子生物学手段 (如：DNA提取、PCR扩增、高通量测序等)，从环境样本中直接获取生物DNA，对目标物种进行遗传标记的识别。与传统生物多样性调查方法相比，环境DNA技术具有灵敏度高、省时省力、无创采样等优点，而且不要求调查人员具有传统的生物识别与鉴定经验。基于高通量测序的环境DNA宏条形码技术可以从一份环境样品实现对目标类群的多个物种的DNA检测，是评估鱼类多样性的有力工具。近年来, 环境DNA宏条形码技术已被广泛运用于淡水和海洋生态系统的渔业管理与鱼类多样性监测中，包括对池塘、溪流、湖泊、河流和海湾等不同水生态系统的鱼类物种组成、鱼类群落结构以及鱼类群落时空分布变化的监测（Keskin et al., 2016; Li et al., 2018; Sigsgaard et al., 2017），在水生生态系统的保护工作中具有广阔的应用前景。Evans等（2017）使用3对鱼类通用引物从面积为2.2公顷的水库中检测出过去传统方法监测到的所有鱼类物种，另外还检测到11种过去未捕获过的鱼类。Balasingham等（2018）使用COI标记从加拿大南部的Grand河流和Sydenham河流中共检测出78种本地鱼类、4种濒危鱼类以及1种入侵鱼类，其检测结果与历史监测结果基本一致。Griffiths等（2020）发现与电捕相比，环境DNA宏条形码技术提高了对英国濒危鱼类欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）的检出率，同时能在采样点检出较高的鱼类多样性。这些研究结果不仅证明了环境DNA宏条形码技术监测目标水域鱼类多样性的有效性，还表明了环境DNA技术更容易检测到相较于传统方法难于捕捉到的稀有物种或隐蔽物种。然而，环境DNA宏条形码无法提供目标物种的种群数量、年龄结构、生理状态和生长发育阶段等信息。其次，环境DNA宏条形码分析依赖分子数据库的完整性，当数据库缺少目标序列时则会导致假阴性检测（Cristescu et al., 2018）。此外，由于水体中环境DNA动态机制的复杂性（Barnes and Turner, 2015），通过环境DNA序列丰度评估物种相对生物量的准确性还有待进一步的研究（Ushio et al., 2018）。尽管环境DNA技术存在一定的局限性，无法完全替代传统的鱼类调查方法，但可以作为一种重要的补充工具，用于快速反映鱼类多样性和鱼类空间分布，减少传统监测对水生生态系统的干扰，缩短调查周期，提高检测效率，为水生生态保护的迅速应答提供可靠数据。目前环境DNA研究针对不同的研究类群和研究水域采用的实验方案均有所不同（Shu et al., 2020），不利于初学者学习环境DNA技术以及开展相关研究，因此总结一套常用的标准流程十分重要。环境DNA宏条形码技术主要由环境DNA获取、遗传标记扩增、高通量测序与测序结果分析四个部分组成，由于环境DNA的获取与遗传标记的扩增是环境DNA技术的关键环节，因此本文仅就这两个部分工作进行了探讨。

材料与试剂

1. 一次性口罩 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BC019)
2. 一次性橡胶手套 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BS-ST-003)
3. 0.45 μm孔径的混合纤维素滤膜 (MCE, Whatman, catalog number: 7141-104)
4. 400目孔径的尼龙纱布 (重庆永捷实验仪器有限公司)
5. 5 ml容量的冻存管 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BS-50-ST)
6. PCR用八连管 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BS-0208-T)
7. PCR用八连盖 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BS-0208-C)
8. 记号笔
9. 冰袋
10. 超纯水
11. 无水乙醇 (重庆川东化工集团有限公司)
    
12. 强力水样DNA提取试剂盒 (PowerWater DNA Isolation Kit, QIAGEN, catalog number: 14900-100-NF)
13. 引物
14. DNA模板
15. 1.1x 浓度的PCR预混液 (1.1x T3 Super PCR Mix, TSINGKE, catalog number: TSE030)
16. 灭菌双蒸水
17. 琼脂糖 (REGULAR AGAROSE G-10, BIOWEST, catalog number: 9012-36-6)
18. 核酸染料 (SYBR^® Safe DNA凝胶染料，ThermoFisher, catalog number: S33102)
19. DNA marker (50bp DNA Ladder, Solarbio, catalog number: M1800)
20. DNA胶回收试剂盒 (AxyPrep DNA Gel Extraction Kit, Axygen, catalog number: AP-GX-50G)
21. 10%浓度的商业漂白水 (见溶液配方)
22. Longmire’s lysis buffer (见溶液配方)
23. 1x TAE缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 1 L容量的塑料瓶
2. 塑料水桶
3. 不锈钢或塑料漏斗
4. 塑料密封箱
5. 灭菌镊子
6. 有机玻璃或不锈钢采水器 (重庆永捷实验仪器有限公司，1,000 ml)
7. 便携式超声波测深仪 (美国SpeedTech, model: SM-5A)
8. 砂芯过滤装置 (天津津腾实验设备有限公司，model: T-50)
9. 超纯水系统 (Millipore, model: Direct-Q 5UV)
10. 普通冰箱 (青岛海尔股份有限公司，model: BCD-451WDIYU1)
11. 低温冰箱 (青岛海尔特种电冰柜有限公司，model: BC/BD-518HD)
12. 紫外灯 (苏州市相城区创新照明电器厂，品牌：虎丘，model: ZWS)
13. 真空泵 (天津华鑫仪器有限公司，model: HX-01)
14. 恒温水浴锅 (上海齐欣科学仪器有限公司，model: DK-8D)
15. 涡旋仪 (配备5 ml适配器；SCILOGEX, model: MX-S)
16. 微量离心机 (配备2 ml转头；Thermo Scientific, model: Sorvall Legend Micro 17)
17. 各种规格移液枪 (配备各种型号枪头；Eppendorf, model: Research plus)
18. 小型离心机 (Kylin-Bell, model: LX-200)
19. 梯度PCR仪 (ABI, model: Veriti)
20. 电泳设备 (Bio-Rad, model: PowerPac Universal)
21. 制胶槽 (配备梳子)
22. 紫外凝胶成像系统 (Bio-Rad, model: Gel Doc XR)
23. 核酸蛋白分析仪 (Thermo Scientific, model: NanoDrop 2000)
    

实验步骤