研究背景

可变剪接是驱动蛋白质多样性的重要调控机制，在生长发育、环境适应、物种分化等多种生物学过程中发挥重要作用，成为目前基因调控机制研究中的热点 (Bush et al., 2017; Schaefke et al., 2018)。同时，可变多聚腺苷酸化作为一种重要的转录后调控机制，通过选择前体mRNA 3’末端不同的多聚腺苷酸化位点 (PAS)，产生具有不同3’UTR长度的转录本，进而影响转录本的稳定性、表达量和翻译效率 (Pereira-Castro and Moreira, 2021)，在疾病发生和各种胁迫响应过程中发挥重要作用 (Sadek et al., 2019; Zheng et al., 2018)，逐渐成为分子生态研究领域的新兴关注热点。全基因组水平可变剪接事件/基因的鉴定和定量是研究可变剪接调控机制的前提，高通量测序技术为可变剪接相关研究提供了良好的技术平台并积累了大量的数据基础。传统的二代测序以通量高、读长短为特点，难以获得完整的转录本全长序列，而转录本重新拼接易造成转录本结构不完整或拼接错误，因此在可变剪接研究中存在一定的局限性。最新的三代测序技术可获得长达25-30 kb的超长读长序列，能够直接获得完整的转录本，进而更准确地开展转录本多样性研究。例如，利用MinION纳米孔测序仪对非小细胞肺癌组织进行全长转录本测序，成功鉴定到癌细胞中的异常剪接转录本，对评估中肿瘤免疫反应具有重要作用，然而这些异常转录本在之前利用短读长高通量测序的相关研究中则处于被忽视状态 (Oka et al., 2021)。然而，由于三代测序相较于二代测序通量低且成本高的特点，三代测序技术尚未全面开展应用，尤其是在生态进化领域中以群体为研究对象的大样本研究中。因此，基于大量积累的二代转录组测序数据，选择合适的分析工具进行可变剪接研究是目前较为常见且可行性较高的研究手段，例如，基于二代测序转录组分析结果表明可变剪接是北极红点鲑 (Salvelinus alpinus) 快速适应不同栖息环境的重要分子调控机制 (Jacobs and Elmer, 2021)，且可变剪接是豌豆蚜虫在不同季节呈现表型多样性的重要分子基础之一 (Grantham and Brisson, 2018)。同样基于二代转录组测序分析结果表明，砷胁迫能够诱导小鼠NIH3T3细胞在全基因组范围内更倾向于选择近端PAS位点造成大量基因3’UTR长度变短，通过逃避RNA降解以保持表达量稳定 (Zheng et al., 2018)。
        目前利用RNA-Seq测序数据进行可变剪接分析的软件有很多，总体来讲分为三大类：基于转录本异构体 (transcript isoform) 的软件如Cufflinks (Trapnell et al., 2013)，基于外显子为统计单元如DEXSeq (Anders et al., 2012)，和利用跨越剪接位点的连接区域 (junction region) 为统计单元的方法如rMATS (Shen et al., 2014) 等。由于二代测序短读长在组装上的劣势造成转录本组装的不准确性，本文选取基于剪接位点的rMATS软件和APAtrap软件分别就其在可变剪接和可变多聚腺苷酸化研究中的常规分析流程进行阐述。

软件版本信息及下载地址

文中所有软件的运行均在Linux操作系统Ubuntu 14环境上进行，数据处理和分析则在个人普通电脑上进行。

1. rMATS v4.1.1 (http://rnaseq-mats.sourceforge.net/rmats4.0.2/; Shen et al., 2014)
2. HISAT2 2.2.1 (https://daehwankimlab.github.io/hisat2/; Kim et al., 2015)
3. Samtools v.1.13 (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/)
4. APAtrap (https://sourceforge.net/projects/apatrap/; Ye et al., 2018)
5. rmats2sashimiplot (https://github.com/Xinglab/rmats2sashimiplot)
6. R v.4.1.0 (https://cran.r-project.org/src/base/R-4/)
   

实验步骤