Estimation of Insect Genome Size by Flow Cytometry

研究背景

自20世纪50年代初期C值 (生物单倍体核DNA的总量) 概念被提出以来，越来越多物种的C值被测定，基因组大小与物种的进化关系、基因组大小变化的原因和结果等话题引起了进化生物学领域激烈的争论 (Swift et al., 1950; Gregory et al., 2013)。而随着技术的发展，基因组大小的检测技术也从原始的复性动力学估算法、脉冲凝胶电泳法、Feulgen密度测定法，发展到如今普遍采用的流式细胞术和基于二代测序读长 (reads) 的k-mer估算法，其中流式细胞术被认为是最可靠、高效快捷和经济的方法。这为探讨基因组进化提供了重要的技术手段 (Gregory et al., 2013)。现有研究结果揭示，昆虫基因组大小差异不仅与基因组的结构 (染色体倍性和非编码DNA的量，尤其是DNA的重复序列) 及进化过程密切相关，而且与昆虫的各种表型特征如发育的速度和发育的复杂性、生命周期策略等有很大的相关性 (Alfsnes et al., 2017; Fan et al., 2019)。总之，基因组大小变化即“C值之谜”还需要更多物种的数据及更多交叉学科的融合来解释。本研究利用流式细胞术测定昆虫基因组大小为探讨C值的进化模式及解析“C值之谜”提供更多的数据支持。

实验原理

碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 是一种可对DNA染色的细胞核荧光染料，不能穿透正常的活细胞膜中，但可以进入失去膜完整性的细胞内与DNA结合。被PI染色的细胞在激光照射下发射荧光，发射的荧光强度与结合的DNA含量成正比。利用流式细胞仪测定细胞的荧光强度从而可推算出细胞的DNA含量。本方法将通过流式细胞术测定昆虫的基因组大小，为理解昆虫基因组大小进化提供数据支持，也为昆虫基因组的测序及组装提供参考。

材料与试剂

1. 流式管
2. 1.5 ml 离心管
3. 20 μm (200目) 尼龙膜 (泽浩，中国)
4. 三角纸袋
5. 肝素抗凝采血管
6. 待测昆虫活体 (如柑橘凤蝶、萤火虫、叶䗛等)
7. 内标样品 (如黑腹果蝇、鸡血等)
8. PBS磷酸缓冲盐溶液 (2 mM KH₂PO₄、8 mM Na₂HPO₄、136 mM NaCl、2.6 mM KCL、pH 7.4)
9. Galbraith's buffer (45 mM MgCl₂、30 mM sodium citrate、20 mM MOPS、0.1% (w/v) TritonX-100、pH 7.0)
10. 碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI)
    

仪器设备

1. 解剖剪
2. 尖头镊子
3. 35 mm培养皿
4. Pellet pestles (Sigma, catalog number: Z359998-1EA)
5. BD Fortessa流式分析仪器 (BD, model: LSR Fortessa)
6. 显微镜 (Nikon, model: SMZ 745)
7. 离心机 (Eppendorf Centrifuge, model: 5810 R)
   

数据分析软件

1. FlowJo v7.6
2. Excel
   

实验步骤